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標(biāo)題基于體外細(xì)胞培養(yǎng)和模型的化妝品抗衰老功效評(píng)價(jià)

提供者：廣東博溪生物科技有限公司發(fā)布時(shí)間：2021/1/5 閱讀次數(shù)：238次 >>進(jìn)入該公司展臺(tái)

本文要點(diǎn)：角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及相關(guān)模型與抗衰老功效評(píng)價(jià)

皮膚衰老的特征指標(biāo)

衰老細(xì)胞發(fā)生的變化：細(xì)胞形態(tài)變大，扁平;衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal) 活性增強(qiáng);p16上調(diào);lamin B1表達(dá)減少;HMGB1核移位至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外液;衰老相關(guān)分泌表型(SASP)的分泌，包括炎癥細(xì)胞因子和金屬蛋白酶......

SASP由促炎細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子和基質(zhì)重塑酶等一系列細(xì)胞因子組成，它們可以導(dǎo)致機(jī)體慢性低度炎癥和疾病，并可以反作用于衰老細(xì)胞及其鄰近細(xì)胞加速它們的衰老進(jìn)程，并可作為新的細(xì)胞衰老效應(yīng)機(jī)制。

圖1 年輕和衰老皮膚示意圖

(Biomarkers of Cellular Senescence ａnd Skin Aging,2018)

圖2 與皮膚衰老相關(guān)的生物指標(biāo)

(Biomarkers of Cellular Senescence ａnd Skin Aging,2018)

基于人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的抗衰老功效評(píng)估

人表皮中的主體細(xì)胞成分是角質(zhì)形成細(xì)胞，此類細(xì)胞經(jīng)過增殖和分化，最終形成包括基底層、棘層、粒層及角質(zhì)層的表皮復(fù)層結(jié)構(gòu) 。人角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮中重要的細(xì)胞，也是紫外線敏感的靶細(xì)胞。近年來研究表明，人角質(zhì)形成細(xì)胞在光老化的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，在加重炎癥反應(yīng)方面也尤為突出。

圖3 炎癥因子含量隨著紫外照射劑量的增加而增加

紫外線可活化Rel家族中的核因子κB，導(dǎo)致細(xì)胞因子、黏附分子以及一氧化氮合成酶和環(huán)氧化酶等炎癥性酶類合成。促炎性細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素（IL）1β、IL⁃6、IL⁃8和腫瘤壞死因子TNF-α等。上述細(xì)胞因子又可通過促進(jìn)活化蛋白1和核因子κB途徑，放大皮膚對(duì)UV照射的反應(yīng)。

人皮膚永生化角質(zhì)細(xì)胞 HaCaT是非腫瘤來源的人正常皮膚角質(zhì)形成永生化細(xì)胞株，較易于培養(yǎng)及傳代。目前 HaCaT細(xì)胞株已被廣泛應(yīng)用于化妝品的抗衰老及透皮性的研究中。

在 Zöller 等的一項(xiàng)體外研究中，比較了培養(yǎng)基中添加溫泉水（理膚泉、雅漾）和飲用天然礦泉水（heppinger、adelholzener）對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞生理參數(shù)的影響。結(jié)果表明，溫泉水被 UV 刺激后產(chǎn)生活性氧，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄測(cè)定，發(fā)現(xiàn)可反轉(zhuǎn)IL⁃6的誘導(dǎo)；天然礦泉水也能對(duì)上述炎性因子產(chǎn)生影響，但程度較輕。

成纖維細(xì)胞的抗衰老功效評(píng)估

人皮膚成纖維細(xì)胞(Human skin fibroblasts, HSF)是人體皮膚真皮中的主體細(xì)胞，具有合成和分泌膠原纖維、彈性纖維及其他機(jī)質(zhì)成分的功能，這些成分和成纖維細(xì)胞共同維持真皮層的彈性。

圖4 成纖維細(xì)胞在自然老化和光老化中的區(qū)別

研究人員證實(shí)，自然老化皮膚的膠原降低是由于成纖維細(xì)胞合成膠原減少，分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1，MMP-2)增加，而光老化皮膚的膠原減少主要是成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶增加，膠原合成下降不明顯。由此可見成纖維細(xì)胞的膠原代謝在自然老化和光老化之間有一定差別。

1 體外增殖能力檢測(cè)

成纖維細(xì)胞除了分泌膠原纖維、彈性纖維維持皮膚彈性之外，還有趨化性和粘附性，對(duì)維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用，HSF的數(shù)量減少是引起皺紋產(chǎn)生的重要原因。

真皮中成纖維細(xì)胞的數(shù)量及活力均會(huì)影響膠原蛋白的分泌、膠原蛋白纖維的數(shù)量以及膠原蛋白纖維束構(gòu)造。成纖維細(xì)胞生長因子是其增殖最有效的刺激因子，可以作為實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照，評(píng)價(jià)化妝品是否有效刺激成纖維細(xì)胞增殖。

圖5 基于成纖維細(xì)胞的樣品增殖效果測(cè)試

2 膠原含量檢測(cè)

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中最活躍的成分之一，是創(chuàng)面愈合和瘢痕形成的關(guān)鍵因素，在皮膚功能修復(fù)中起重要作用。正常成人皮膚中HSF分泌的膠原主要以Ⅰ和Ⅲ 型為主。其中Ⅰ型膠原是構(gòu)成正常成人皮膚的主體，而正常胎兒皮膚主要由Ⅲ型膠原組成。

膠原含量的測(cè)定有多種方法，通過ELISA 法和western Blot和免疫熒光等方法可分別精確定量體外培養(yǎng)的HSF分泌及細(xì)胞本身膠原含量的變化。

圖6 基于成纖維細(xì)胞的膠原蛋白定量檢測(cè)（免疫熒光法；來自博溪生物）

3 抗氧化功效檢測(cè)

正常人體細(xì)胞每天生化代謝產(chǎn)生大量的ROS。細(xì)胞中過氧化物酶發(fā)揮了清除ROS的功能，起抗氧化作用。其中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）在自由基生成的起始階段發(fā)揮預(yù)防性作用，而谷胱甘肽過氧化物酶（GSH- Px）發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化作用。

通過流式細(xì)胞術(shù)直接檢測(cè) HSF內(nèi)ROS水平的改變、通過比色法檢測(cè)SOD，CAT 和GSH-Px等酶活性的變化，均能靈敏反映出化妝品抗氧化功效。

4 其他衰老相關(guān)生物指標(biāo)檢測(cè)

衰老細(xì)胞通常體積變大，溶酶體衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）酶活性增高。采用免疫組化法觀察β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞的顏色變化以及用比色法定量β-半乳糖苷酶活性，可以評(píng)估HSF衰老程度的變化。

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化重要產(chǎn)物，在衰老過程中顯著累積，與皮膚老年斑（褐脂質(zhì)）含量呈正相關(guān)。目前ＭＤA被認(rèn)為是一種重要的衰老生物標(biāo)記物，通過ELISA法檢測(cè)MDA含量變化是比較靈敏的HSF老化評(píng)價(jià)方法。

5 案例展示

Wang等發(fā)現(xiàn)紫外線輻照后成纖維細(xì)胞中 SA-β-gal 活性增強(qiáng)，作為衰老的生物標(biāo)志物之一，表明 UVB 照射誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài);同時(shí)觀察到染料木素能有效地抑制 SA-β-gal 的表達(dá)，且呈劑量依賴性（SA-β-gal 染色陽性細(xì)胞為藍(lán)色）。

Wang Y N , Wu W , Chen H C , et al. Genistein protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal fibroblast by p66Shc down-regulation[J]. Journal of Dermatological ence, 2010, 58(1):19-27.

圖7 UVB 照射誘導(dǎo) HDFs 中 SA-β-gal 表達(dá)及染料木黃酮的保護(hù)作用

接下來，用不同濃度的染料木黃酮處理細(xì)胞24小時(shí)，ELISA檢測(cè) HDFs 細(xì)胞內(nèi) SOD 和 MDA 水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使在沒有 UVB 照射的情況下，染料木黃酮處理仍能誘導(dǎo) HDFs 中 SOD 活性并抑制細(xì)胞內(nèi) MDA 水平。

UVB 輻照導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) SOD 活性顯著降低，同時(shí)細(xì)胞內(nèi) MDA 水平升高，說明 HDFs 對(duì) UVB 的氧化應(yīng)激反應(yīng)增加。而加入不同濃度的染料木黃酮后，引起細(xì)胞內(nèi) SOD 活性的增加，在高劑量時(shí) MDA 水平顯著降低。

圖8 不同濃度的染料木黃酮對(duì)成纖維細(xì)胞內(nèi)SOD和MDA水平的影響

三維皮膚模型抗衰老功效評(píng)價(jià)

隨著三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，三維人造皮膚模型可以在體外培養(yǎng)中模擬人體皮膚構(gòu)造以及皮膚不同細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的各種反應(yīng)，使它更有效地應(yīng)用于化妝品工業(yè)，對(duì)于快速篩選新型功效性原料具有實(shí)際意義。

在三維皮膚模型上評(píng)價(jià)抗皺劑等的功效性與單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，更接近于生物體的真實(shí)狀態(tài)，可以用于毒性分析和功效測(cè)試，是保證化妝品安全功效的重要手段。

實(shí)驗(yàn)時(shí)將活性物質(zhì)配制成膏霜等劑型，涂于重建皮膚模型上，通過測(cè)試相關(guān)指標(biāo)，如清除自由基能力、抗氧化能力和膠原蛋白含量，可以考察化妝品對(duì)細(xì)胞增殖分化及抗氧化能力的影響。

圖9 3D皮膚模型的給藥方式（來自博溪生物）

基于三維皮膚模型的抗衰老功效評(píng)價(jià)體系，可以分為抗表皮衰老和抗真皮衰老。兩者可以通過構(gòu)建不同的模型來實(shí)現(xiàn)更好的生物學(xué)指標(biāo)響應(yīng)。

比如表皮模型是由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建形成，如下圖所示。構(gòu)建完成后，通過低劑量的UV照射連續(xù)照射進(jìn)行干預(yù)，隨后對(duì)組織形態(tài)、屏障相關(guān)指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

圖10 體外重組表皮模型的工藝流程及評(píng)測(cè)指標(biāo)

此外還可以通過構(gòu)建全層皮膚模型進(jìn)行真皮抗衰的評(píng)價(jià)。它的特點(diǎn)在于有真表皮結(jié)構(gòu)，可以在體外進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)含量變化的檢測(cè)，從而進(jìn)行抗衰老原料特別是化妝品成品的篩選。詳情可點(diǎn)擊鏈接《它為什么可以評(píng)估化妝品抗光損傷的效果？》

離體皮膚

離體皮膚的特點(diǎn)在于它天然而復(fù)雜組織構(gòu)成：包括了天然表皮層和真皮層，真皮層中的纖維包括膠原纖維（95%）、彈力纖維和網(wǎng)狀纖維等，這樣的天然構(gòu)成，使一體化地觀測(cè)受試樣品對(duì)皮膚的綜合或者特定影響成為可能。

但是，離體皮膚難獲取、難培養(yǎng)也使很多研究者望而卻步。

目前博溪生物已經(jīng)攻克了離體皮膚培養(yǎng)的問題，并應(yīng)用離體皮膚來進(jìn)行化妝品的功效評(píng)價(jià)。首先要解決的核心問題是“長程培養(yǎng)”的問題。目標(biāo)是要讓離體皮膚單元保持正常的生理活性，以滿足各類檢測(cè)、樣品長時(shí)間暴露的需求，同時(shí)關(guān)注增殖與分化指標(biāo)的平衡問題。

1 離體皮膚的培養(yǎng)

1）首先從臨床取得捐獻(xiàn)的離體皮膚組織，用皮膚取樣器分割成一定大小的單元，用于后續(xù)研究；

2）對(duì)離體皮膚單元進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，這是最為關(guān)鍵的步驟；在博溪生物的體系中，采用了自主開發(fā)的培養(yǎng)基來進(jìn)行，這也得益于一直專注于皮膚模型開發(fā)的培養(yǎng)基技術(shù)的積累。

3）培養(yǎng)完成之后，收集離體皮膚單元，進(jìn)行具體指標(biāo)的檢測(cè)。

圖11 離體皮膚的培養(yǎng)流程

2 基于Exvivo的抗衰老評(píng)價(jià)體系

在光輻照的誘導(dǎo)下，皮膚細(xì)胞經(jīng)歷高水平、長期的氧化應(yīng)激損傷；氧化應(yīng)激和慢性炎癥又進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的水平降低和細(xì)胞功能的老化；因此，我們?cè)诳顾プo(hù)膚品設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)中，可以從拮抗氧化應(yīng)激、增加ECM合成、降低ECM降解、以及修復(fù)衰老細(xì)胞等角度入手。

圖11 基于離體皮膚(ex vivo skin)的抗衰評(píng)價(jià)指標(biāo)

3 案例展示：樣品對(duì)離體皮膚(ex vivo skin)彈性纖維的影響

圖12 免疫組化法檢測(cè)樣品對(duì)離體皮膚彈性纖維的影響（博溪生物）

結(jié)論：從IHC染色結(jié)果看，對(duì)照組真皮層內(nèi)可見長束狀彈性纖維，排列均勻、有序，UVR 照射處理后彈性纖維減少，排列稀疏、多呈斷層式分布。陽性物質(zhì)使用后，彈性纖維密度明顯提升。

上述方法，匯總和梳理了基于體外細(xì)胞培養(yǎng)和模型建立的抗衰老功效評(píng)價(jià)方法，旨在針對(duì)不同的功效和評(píng)價(jià)需求,體外培養(yǎng)特定細(xì)胞或建立細(xì)胞損傷模型,使用目標(biāo)成分刺激，觀察細(xì)胞形態(tài)和毒性增殖等指標(biāo),通過分析特定基因通路、相關(guān)蛋白表達(dá)等分子生物學(xué)手段對(duì)原料或者成品進(jìn)行功效評(píng)價(jià)。

由于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具有經(jīng)濟(jì)成本較低、實(shí)驗(yàn)周期較短、實(shí)驗(yàn)對(duì)象相對(duì)穩(wěn)定且操作方法成熟等特點(diǎn),應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)方法建立體外培養(yǎng)皮膚細(xì)胞模型成為化妝品原料篩選和活性物質(zhì)功效評(píng)價(jià)的主流方法之一。

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