紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內測定物質的吸光度，用于鑒別、雜質檢查和定量測定的方法。當光穿過被測物質溶液時，物質對光的吸收程度隨光的波長不同而變化。因此，通過測定物質在不同波長處的吸光度，并繪制其吸光度與波長的關系圖即得被測物質的吸收光譜。從吸收光譜中，可以確定大吸收波長；λ_max和小吸收波長λ_min。物質的吸收光譜具有與其結構相關的特征性。因此，可以通過特定波長范圍內樣品的光譜與對照光譜或對照品光譜的比較，或通過確定大吸收波長，或通過測量兩個特定波長處的吸光度比值而鑒別物質。用于定量時，在大吸收波長處測量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對照溶液的吸光度進行比較或采用吸收系數(shù)法求算出樣品溶液的濃度。
　　儀器的校正和檢定
　　1. 波長   

由于環(huán)境因素對機械部分的影響，儀器的波長經(jīng)常會略有變動，因此除應定期對所用的儀器進行全面校正檢定外，還應于測定校正測定波長。常用汞燈中的較強譜線237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm；或用儀器中氘燈的486.02nm與656.l0nm譜線進行校正；鈥玻璃在波長279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長校正用，但因來源不同或隨著時間的推移會有微小的變化，使用時應注意；近年來，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥（Ho₂O₃）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。
　　儀器波長的允許誤差為：紫外光區(qū)±lnm，500nm附近±2nm。
　　2. 吸光度的準確度   

可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重的基準重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml，在規(guī)定的波長處測定并計算其吸收系數(shù)，并與規(guī)定的吸收系數(shù)比較，應符合表中的規(guī)定。

　　
　　3.雜散光的檢查 

可按下表所列的試劑和濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長處測定透光率，應符合表中的規(guī)定。

　　對溶劑的要求
　　含有雜原子的有機溶劑，通常均具有很強的末端吸收。因此，當作溶劑使用時，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長。例如甲醇、乙醇的截止使用波長為205nm。另外，當溶劑不純時，也可能增加干擾吸收。因此，在測定供試品，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質）測定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度，在220～240nm范圍內不得超過0.40，在241～250nm范圍內不得超過0.20，在251～300nm范圍內不得超過0.10，在300nm以上時不得超過0.05。
　　測定法
　　測定時，除另有規(guī)定外，應以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用lcm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長±2nm以內測試幾個點的吸光度，或由儀器在規(guī)定波長附近自動掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確。除另有規(guī)定外，吸收峰波長應在該品種項下規(guī)定的波長士2nm以內，并以吸光度大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸光度讀數(shù)，以在0.3～0.7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半高寬度的1/10，否則測得的吸光度會偏低；狹縫寬度的選擇，應以減小狹縫寬度時供試品的吸光度不再增大為準。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸光度后應減去空白讀數(shù)，或由儀器自動扣除空白讀數(shù)后再計算含量。
　　當溶液的pH值對測定結果有影響時，應將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調成一致。
　　1. 鑒別和檢查    分別按各品種項下規(guī)定的方法進行。
　　2. 含量測定    一般有以下幾種方法。
　�。�1）對照品比較法    按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規(guī)定量的100%±10%，所用溶劑也應完全一致，在規(guī)定的波長處測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度：
　　c_X = （A_X/A_R）c_R
　　式中 c_X為供試品溶液的濃度；
　　A_X為供試品溶液的吸光度；
　　c_R為對照品溶液的濃度；
　　A_R為對照品溶液的吸光度。
　�。�2）吸收系數(shù)法    按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計算含量。用本法測定時，吸收系數(shù)通常應大于100，并注意儀器的校正和檢定。
　�。�3）計算分光光度法    計算分光光度法有多種，使用時應按各品種項下規(guī)定的方法進行。當吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，波長的微小變化可能對測定結果造成顯著影響，故對照品和供試品的測試條件應盡可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。
　�。�4）比色法    供試品本身在紫外-可見光區(qū)沒有強吸收，或在紫外光區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當?shù)娘@色劑，使反應產(chǎn)物的大吸收移至可見光區(qū)，這種測定方法稱為比色法。
　　用比色法測定時，由于顯色時影響顯色深淺的因素較多，應取供試品與對照品或標準品同時操作。除另有規(guī)定外，比色法所用的空白系指用同體積的溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應試劑，并用同樣方法處理。在規(guī)定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸光度后，按上述（1）法計算供試品濃度。
　　當吸光度和濃度關系不呈良好線性時，應取數(shù)份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一體積，顯色后測定各份溶液的吸光度，然后以吸光度與相應的濃度繪制標準曲線，再根據(jù)供試品的吸光度在標準曲線上查得其相應的濃度，并求出其含量。