摘要：本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5413.36—2010 《嬰幼兒食品和乳品中反式脂肪酸的測(cè)定》中提供的方法對(duì)奶粉中反式脂肪酸含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中首先用有機(jī)溶劑對(duì)奶粉中的脂肪進(jìn)行提取，然后在堿性條件下對(duì)提取的脂肪進(jìn)行甲酯化，形成脂肪酸甲酯。最后，再用配有氫火焰離子化檢測(cè)器的氣相色譜儀分離順式脂肪酸甲酯和反式脂肪酸甲酯，并進(jìn)行外標(biāo)法定量。

關(guān)鍵詞：反-9-十八碳一烯酸甲酯、反-9，12-十八碳二烯酸甲酯、外標(biāo)法、脂肪

反式脂肪酸也稱反式脂肪，它可分為兩類：一類是天然的，存在于牛羊肉和牛羊奶中的反式脂肪；一類是人工制造的，是在動(dòng)植物油脂加工和烹調(diào)過程中產(chǎn)生的。長(zhǎng)期、過量食用反式脂肪酸，會(huì)嚴(yán)重危害人體健康。

“減少含反式脂肪酸食物的攝入”是衛(wèi)生部一直在積極倡導(dǎo)的健康生活方式。嬰幼兒食品和乳品中反式脂肪酸含量較低，但長(zhǎng)期食用會(huì)干擾嬰幼兒必需脂肪酸的利用，并造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，因此對(duì)食品中反式脂肪酸進(jìn)行規(guī)定、監(jiān)督、檢測(cè)其含量。

1         實(shí)驗(yàn)部分

1.1    試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

石油醚：沸程 30 ℃～60 ℃。

乙醚：分析純。

95 %乙醇：分析純。

正己烷：色譜純。

氨水：25 %～28 %，分析純。

氫氧化鉀：分析純。

甲醇：分析純。

無水硫酸鈉：分析純。

脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品：反-9-十八碳一烯酸甲酯（C18:1-9t）、反-9，12-十八碳二烯酸甲酯（C18:2-9t，12t）。

4 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液：稱取 26.4 g 氫氧化鉀，溶于約 80 mL甲醇中。冷卻至室溫，用甲醇定容至 100 mL，加入約 5g 無水硫酸鈉，充分?jǐn)嚢韬筮^濾，保留濾液。

標(biāo)樣配制：

反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液：濃度分別為 10.0 mg/ mL。稱取 100 mg（精確到 0.1 mg）反-9-十八碳一烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品和反-9，12-十八碳二烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，分別用正己烷溶解并定容至 10.0 mL。放入冰箱在-15 ℃以下保存。

反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)中間液：濃度分別為 1.0 mg/ mL。分別吸取兩種反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.0 mL 入同一 50 mL 容量瓶中并用正己烷定容。臨用前配制。亦作為標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度。

反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)工作液：臨用前配制。分別吸取反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)中間液，0、2.0、6.0、8.0、10.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用正己烷定容，此濃度即為 0、0.2、0.6、0.8、1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2儀器及工作條件

恒溫水�。�40 ℃～80 ℃

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000 轉(zhuǎn)/分鐘

分析天平：感量為 0.1 mg

渦旋振蕩器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器

毛氏抽脂瓶

GC4000A 氣相色譜儀

GC儀器條件：

色譜柱：HP-88  100m×0.25mm×0.20μm    汽化室溫度：250℃ 

柱箱溫度：初時(shí)溫度120℃ 三階程升到230℃. FID檢測(cè)器溫度：300℃

載氣：高純N₂   分流比：70:1  柱流速：1mL/min   進(jìn)樣量：1μL 

程升條件：

表1 GC程升條件

1.3樣品處理過程

稱取混合均勻的固體試樣約 1.5 g（精確到 0.1 mg）于毛氏抽脂瓶中，加入10 mL 45 ℃±2 ℃的水，將試樣洗入毛氏抽脂瓶的小球中，充分混合，直到試樣完全散開，冷卻至室溫。

脂肪的提�。合蛎�氏抽脂瓶中加入 3.0 mL 氨水，混勻。置于 60 ℃±2 ℃水浴中 15 min～20 min，冷卻至室溫。加入 10 mL乙醇和1 滴剛果紅溶液，混勻。再加入25mL 乙醚，塞上瓶塞，手動(dòng)震蕩 1 min。再加入 25mL 石油醚， 震蕩 1 min， 4000 轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，傾出上清液于圓底燒瓶（與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀配套）中，為第一次提取。在剩余試樣液中再加入5 mL 乙醇，25 mL 乙醚，25 mL 石油醚按上述操作步驟進(jìn)行第二次提取。用離心機(jī)離心分層后傾出上清液與第一次的上清液合并。將圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在 60 ℃±2 ℃通入氮?dú)鈼l件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，保留殘?jiān)�，即為脂肪�?/span>

脂肪酸甲酯的制備：將上述脂肪用正己烷溶解并定容至 10.0 mL，取出 3.0 mL 于 10 mL具塞試管中，加入 0.3 mL 氫氧化鉀-甲醇溶液。蓋緊瓶蓋，渦旋振蕩器上劇烈振搖 2 min，4000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 5 min 后將上清液轉(zhuǎn)入氣相色譜試樣瓶中，此為試樣測(cè)定液。

2         結(jié)果與討論

2.1    標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)配制的反式脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度梯度如下：

表2  標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度梯度

在上述儀器條件下，根據(jù)濃度和峰面積分別繪制兩種反式脂肪酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1至圖3，其中圖1為標(biāo)準(zhǔn)液的色譜分離譜圖。實(shí)驗(yàn)獲得反-9-十八碳一烯酸甲酯在0~0.9mg/mL，反-9,12-十八碳二烯酸甲酯在0~0.85mg/mL時(shí)濃度和峰面積良好的線性關(guān)系，它們分別的相關(guān)系數(shù)為0.9991和0.9995。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)液的色譜分離譜圖

圖2 反-9-十八碳一烯酸甲酯的校準(zhǔn)曲線

曲線方程：Y = 35223.966102X +0.0000

相關(guān)系數(shù)：r = 0.9991

圖3 反-9，12-十八碳二烯酸甲酯的校準(zhǔn)曲線

曲線方程：Y = 30457.65138 X +0.0000

相關(guān)系數(shù)：r = 0.9995

2.2    實(shí)際樣品分析結(jié)果

按照上述的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)兩個(gè)奶粉樣品分別進(jìn)行反式脂肪酸的提取及甲酯化，并進(jìn)行氣相分析。根據(jù)奶粉樣品中反-9-十八碳一烯酸甲酯和反-9,12-十八碳二烯酸甲酯的峰面積，按各自的校準(zhǔn)曲線，利用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，獲得不同樣品提取物中反-9-十八碳一烯酸甲酯和反-9,12-十八碳二烯酸甲酯的濃度。

結(jié)果如表3所示。圖4、圖5分別為1#樣品和2# 樣品的色譜分析譜圖。

圖4 1#樣品色譜分析譜圖

圖5 2#樣品色譜分析譜圖

表3 樣品提取物中反式脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度

上述得到的結(jié)果是樣品提取物中反式脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度，根據(jù)這個(gè)結(jié)果再結(jié)合公式1即可計(jì)算出樣品中反-9-十八碳一烯酸和反-9,12-十八碳二烯酸的具體含量。再根據(jù)公式2計(jì)算出樣品中反式脂肪酸的總含量。計(jì)算結(jié)果如表4所示。

    公式1

式中：

X_（1或2） —— 樣品中反十八碳一烯酸或反十八碳二烯酸含量，單位為 mg/100g；

V —— 樣品的定容體積，單位為 mL；

m —— 樣品質(zhì)量，單位為 g；

c_i—— 試樣測(cè)定液中反十八碳一烯酸甲酯或反十八碳二烯酸甲酯的質(zhì)量濃度，單位為 mg/mL；

M_ai —— 反十八碳一烯酸（282.46）或反十八碳二烯酸（280.45）的分子量；

M_bi —— 反十八碳一烯酸甲酯（296.49）或反十八碳二烯酸甲酯（294.47）的分子量。

樣品中反式脂肪酸的總含量 X，按下式計(jì)算：

                公式2

式中：

X——反式脂肪酸的總含量，單位為 mg/100g ；

X₁——試樣中反十八碳一烯酸的含量，單位為 mg/100g ；

X₂——試樣中反十八碳二烯酸的含量，單位為 mg/100g。

表4 樣品中反式脂肪酸的含量

2.3精密度實(shí)驗(yàn)

在重復(fù)性條件下進(jìn)行兩次獨(dú)立測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，計(jì)算精密度。計(jì)算結(jié)果如表5所示。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.結(jié)論

本文采用氣相色譜石英毛細(xì)柱外標(biāo)法測(cè)定奶粉中的反式脂肪酸含量，兩種反式脂肪酸在各自的濃度范圍內(nèi)都有良好的線性范圍，相關(guān)系數(shù)r≥0.999，儀器和方法均具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。對(duì)2種奶粉樣品進(jìn)行了檢測(cè)分析結(jié)果所示，兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果間的精密度小于10%，完全符合國(guó)標(biāo)要求。