摘要報(bào)告了用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血清中頭孢哌酮和舒巴坦的含量。本法以外標(biāo)法為基礎(chǔ)，0.5mL血清標(biāo)本經(jīng)甲醇沉淀蛋白，離心后上清液進(jìn)樣。

　　色譜分析條件：以C18反相柱作分析柱，流動(dòng)相組成為0.005mmol/L四丁基氫氧化銨—乙腈（825∶175，V/V），磷酸調(diào)整pH至5.0，流速為1.0mL/min，在紫外檢測(cè)器230nm進(jìn)行檢測(cè)。本法的頭孢哌酮和舒巴坦的最低檢出濃度分別為10mg/L和5mg/L，至少在10～1000mg/L范圍內(nèi)呈線性，頭孢哌酮和舒巴坦的絕對(duì)回收率分別是99.4％～102.9％和95.0％～105.3％，批內(nèi)和批間RSD分別是1.4％、1.5％和1.8％、1.9％。對(duì)10種臨床常用的β-內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)有干擾峰。β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生已迅速波及到許多種類的細(xì)菌并且已經(jīng)成為影響β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要威脅，以至許多頭孢菌素對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌并不具有“深譜”抗菌能力，舒普深（Sulperazon）內(nèi)含舒巴坦鈉和頭孢哌酮鈉；由于舒巴坦（Sulbactam）是一種強(qiáng)有力的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，而頭孢哌酮（Cefoperazone）是第三代頭孢菌素類抗生素，具有廣譜的抗菌作用，兩者聯(lián)合具有明顯的協(xié)同作用，是一種全新的廣譜加上深譜的頭孢菌素類抗生素，在臨床治療中廣泛使用。但如果用藥不當(dāng)會(huì)產(chǎn)生副作用或未達(dá)到合理用藥的目的。因此，測(cè)定血液中該藥物的濃度，對(duì)于研究不同疾病條件下該藥物的作用機(jī)理、藥代動(dòng)力學(xué)以及制定合理的給藥方案十分必要。用高效液相色譜法測(cè)定舒巴坦和頭孢哌酮的方法已有很多報(bào)道，但絕大多數(shù)方法是在一個(gè)色譜條件下測(cè)定一種藥物，為此，筆者建立了一種能同時(shí)測(cè)定血清頭孢哌酮和舒巴坦含量的高效液相色譜法。該法在保證足夠的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度的前提下，達(dá)到操作簡(jiǎn)便、節(jié)約有機(jī)溶劑、節(jié)省人力和時(shí)間的目的。

　　1、測(cè)定原理

　　以外標(biāo)法為基礎(chǔ)，血清樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白，取上清液過(guò)濾，濾液直接進(jìn)樣，用C18反相柱進(jìn)行色譜分析，紫外檢測(cè)器在230nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積定量。

　 2、材料和方法

　　2.1 標(biāo)本的收集和保存抽取血液放入普通玻璃試管中（勿溶血），分離血清后立即測(cè)定，如不能立即測(cè)定應(yīng)將血清密封，置4℃冰箱或-20℃下保存，一周內(nèi)測(cè)定。

　　2.2 儀器高效液相色譜儀：包括Waters510泵，486紫外可見光檢測(cè)器，U6K進(jìn)樣閥，PC800色譜工作站，AST486微機(jī)。平頭微量注射器：Hamilton25μL，美國(guó)。樣品過(guò)濾器：NewHydePark，日本。樣品過(guò)濾膜：Millipore0.5μm，美國(guó)。離心沉淀機(jī)：LXJ—Ⅱ型，南京第一醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。

　　2.3 試劑標(biāo)準(zhǔn)物：頭孢哌酮（純度為93.8％）和舒巴坦（純度為99.5％）均由中國(guó)大連輝瑞制藥有限公司提供。溶劑：四丁基氫氧化銨和磷酸為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭�；乙腈和甲醇為�?guó)產(chǎn)色譜試劑；水為Millipore超純水器生產(chǎn)。

　　2.4 溶液配制

　　標(biāo)準(zhǔn)液：室溫下分別配制濃度為1g/L的頭孢哌酮和舒巴坦的甲醇溶液，密封。置4℃冰箱保存，用前取出放至室溫后使用。血清標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：參考舒普深血清藥代動(dòng)力學(xué)資料，確定兩藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的血清藥物濃度（表1）。用健康正常人無(wú)藥混合血清配制。將不同濃度的血清標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液分裝，密封，置-20℃保存，至少在二周內(nèi)是穩(wěn)定的。

　　2.5 樣品預(yù)處理取所需數(shù)目的6mL圓底帶塞試管，于試管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)血清應(yīng)用液、空白無(wú)藥血清和病人標(biāo)本各0.5mL。于各管中準(zhǔn)確加入甲醇0.5mL，旋渦1min，離心（3000r/min）15min。吸取上清液過(guò)濾，取濾液20μL進(jìn)樣。

　　2.6 色譜分析條件分析柱：Nova-PakR○C184μm，3.9mm×150mm，檢測(cè)波長(zhǎng)：UV230nm，流速：1.0mL/min。柱溫：室溫。

　　2.7 計(jì)算在PC800色譜工作站中設(shè)置好各有關(guān)參數(shù)，得出頭孢哌酮和舒巴坦的血清標(biāo)準(zhǔn)物的峰面積。以各藥標(biāo)準(zhǔn)血清的峰面積為縱坐標(biāo)，其相應(yīng)的血藥濃度為橫坐標(biāo)，分別繪制各藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由待測(cè)標(biāo)本的峰面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相應(yīng)的血藥濃度。亦可根據(jù)各藥的峰面積與血藥濃度的回歸方程，計(jì)算標(biāo)本的血藥濃度。

　　3、結(jié)果

　　3.1 檢出限以引起兩倍于噪音的藥量為最低檢出量，以經(jīng)預(yù)處理后的進(jìn)樣藥量等于最低檢出量的標(biāo)本藥物濃度為最低檢出濃度。本法的最低檢出濃度分別是：頭孢哌酮為10mg/L，舒巴坦為5mg/L。

　　3.2 干擾實(shí)驗(yàn)在上述色譜條件下，對(duì)10種臨床常用的β-內(nèi)酰胺類藥物（氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、青霉素G鈉鹽、氧哌嗪青霉素、克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢呋辛進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)，均未發(fā)現(xiàn)有干擾峰。

　　4、討論

　　4.1 色譜體系的選擇在分析堿性藥物時(shí)，多采用反相柱，它可使血液中的內(nèi)源性強(qiáng)極性成分快速洗脫下來(lái)，避免對(duì)測(cè)定藥物的干擾，同時(shí)也縮短了測(cè)定時(shí)間，筆者采用了C18反相柱進(jìn)行分離。固定相確定以后，流動(dòng)相的組分對(duì)被測(cè)物的色譜分離起著決定性的作用，筆者曾試用甲醇（多種比例）作為流動(dòng)相中的強(qiáng)溶劑，分離度和峰形均不令人滿意，改用乙腈作為強(qiáng)溶劑和用四丁基氫氧化銨作為添加劑，且按照一定比例配制及調(diào)整pH，就獲得了滿意的分離度。

　　4.2 樣品的預(yù)處理本法樣品處理操作簡(jiǎn)單、快速，試劑易得，基本上能滿足臨床檢測(cè)的要求，如需提高檢測(cè)靈敏度，還需要將提取液進(jìn)一步濃縮和重組，然后再進(jìn)樣分析，此有待進(jìn)一步摸索改進(jìn)。

　　4.3 方法概述和應(yīng)用實(shí)例采用本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的流動(dòng)相能將舒普深中頭孢哌酮和舒巴坦完全分離，雖然舒巴坦中常含有堿性降解物，但它并不干擾本法含量測(cè)定；分離后雖然用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算出組分的含量。但由于樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)單，人為影響因素少，且通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)證明本法的特異性強(qiáng)，靈敏度較高，重現(xiàn)性和回收率結(jié)果良好，另外，通過(guò)比較，無(wú)論是用峰面積或是峰高計(jì)算結(jié)果，均無(wú)明顯差別。本方法建立以后，已對(duì)臨床90多人次燒傷病人用藥后的血清標(biāo)本進(jìn)行了測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)和藥物的代謝產(chǎn)物的干擾，說(shuō)明本法能夠滿足對(duì)舒普深臨床血藥濃度和藥代動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)的要求。