摘要：本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.27—2010 《嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定》中提供的方法對奶粉中的六種脂肪酸含量進(jìn)行測定。這六種脂肪酸分別為月桂酸、肉豆蔻酸、γ-亞麻酸、α-亞麻酸、芥酸和花生四烯酸（ARA）。

實(shí)驗(yàn)中首先用有機(jī)溶劑對奶粉中的脂肪進(jìn)行提取，然后再對提取的脂肪進(jìn)行皂化生成游離的脂肪酸，最后在三氟化硼的催化下進(jìn)行甲酯化反應(yīng)。形成的脂肪酸甲酯用配有氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀進(jìn)行分析，并進(jìn)行外標(biāo)法定量。

關(guān)鍵詞：脂肪酸、皂化、三氟化硼、外標(biāo)法

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1    試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

石油醚：沸程 30 ℃～60 ℃。

乙醚：分析純。

99.8% 無水乙醇：優(yōu)級純

正己烷：色譜純。

氨水：25 %～28 %，分析純。

氫氧化鉀：分析純。

甲醇：色譜純。

三氟化硼甲醇溶液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14 %。

飽和氯化鈉溶液：溶解18 g 氯化鈉于50 mL 水中，攪拌溶解，澄清備用。

0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液：稱取2.8g 氫氧化鉀，用甲醇溶解并稀釋定容至 100 mL，混勻。

焦性沒食子酸甲醇溶液（10 %）：將1.0 g 焦性沒食子酸溶于10 mL 甲醇中配制成10 %焦性沒食子酸甲醇溶液備用。

脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品：月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、γ-亞麻酸甲酯、α-亞麻酸甲酯、芥酸甲酯和花生四烯酸甲酯，均購自百靈威試劑有限公司。

標(biāo)樣配制：按試樣中各脂肪酸含量及所要分析脂肪酸的種類適當(dāng)配制其濃度，正己烷定容并貯存于－10 ℃以下的冰箱中，有效期三個(gè)月。實(shí)驗(yàn)中脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液按表1所示的濃度配制。

表1 脂肪酸甲酯標(biāo)液配制濃度

1.2儀器及工作條件

恒溫水浴：40 ℃～80 ℃

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥5000 轉(zhuǎn)/分鐘

分析天平：感量為 0.1 mg

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器

抽脂管：100 mL 磨口具塞試管，抽脂管干燥、恒重。

GC4000A 氣相色譜儀

GC儀器條件：

色譜柱：PC-2560  100m×0.25mm×0.20μm； 汽化室溫度：260℃； FID檢測器溫度：280℃； 載氣：高純N₂ ； 分流比：60:1； 柱流速：1mL/min； 進(jìn)樣量：1μL； 柱箱溫度：初時(shí)溫度140℃，保持5min后以4℃/min，升溫至240℃，保持30min。

1.3樣品處理過程

稱取試樣1.0 g（精確到0.1 mg）至抽脂管中，加入65 ℃ ±1 ℃的水10 mL 溶解試樣，振搖，使樣品完全分散。于上述試樣中加入2 mL氨水，于65 ℃ ±1 ℃水浴鍋中放置15 min，取出輕搖，冷至室溫。

脂肪的提�。涸谥苽浜玫臉悠分屑尤�10 mL 乙醇，混勻。加入25 mL 乙醚，加塞振搖1 min。加入25 mL 石油醚，加塞振搖1 min，靜置、分層，有機(jī)層轉(zhuǎn)入磨口燒瓶中。再加入25 mL 乙醚及25 mL石油醚，加塞振搖1 min，靜置、分層，有機(jī)層轉(zhuǎn)入磨口燒瓶中，再重復(fù)操作一次。合并抽提液于磨口燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干。

皂化酯化：在濃縮物中加入1.0 mL 焦性沒食子酸甲醇溶液。濃縮干燥之后再加入10 mL 氫氧化鉀甲醇溶液置于80 ℃ ±1 ℃水浴上回流5 min～10 min。再加入5 mL 三氟化硼甲醇溶液，繼續(xù)回流15 min，冷卻至室溫，將燒瓶中的液體移入50 mL 離心管中，分別用3 mL 飽和氯化鈉溶液清洗燒瓶三次，合并飽和氯化鈉溶液于50 mL 離心管，加入10 mL 正己烷，振搖后，以5000 轉(zhuǎn)/分鐘離心5 min，取上清液作為試液，供氣相色譜儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1    標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)最后配制的反式脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度梯度如下：

表2  標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度梯度

在上述儀器條件下，根據(jù)濃度和峰面積分別繪制六種脂肪酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1至圖7。其中，圖1為標(biāo)準(zhǔn)液的色譜分離譜圖。實(shí)驗(yàn)獲得的六種脂肪酸甲酯在各自的工作液濃度范圍內(nèi)，濃度和峰面積都有良好的線性關(guān)系，它們分別的相關(guān)系數(shù)≥0.9992。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)液的色譜分離譜圖

圖2 月桂酸甲酯的校準(zhǔn)曲線

曲線方程:Y = 134960.061152 X +0.0000

相關(guān)系數(shù): : 0.9997

圖3 肉豆蔻甲酯的校準(zhǔn)曲線

曲線方程:Y = 127750.180003 X +0.0000

相關(guān)系數(shù): : 0.9992

圖4 γ-亞麻酸甲酯的校準(zhǔn)曲線

曲線方程:Y = 107931.594661 X +0.0000

相關(guān)系數(shù): : 0.9998

圖5 α-亞麻酸甲酯的校準(zhǔn)曲線

曲線方程:Y = 95870.460842 X +0.0000

相關(guān)系數(shù): : 0.9993

圖6 芥酸甲酯的校準(zhǔn)曲線

曲線方程:Y = 89144.257336 X +0.0000

相關(guān)系數(shù): : 0.9996

圖7 花生四烯酸甲酯的校準(zhǔn)曲線

曲線方程:Y = 80563.999173 X +0.0000

相關(guān)系數(shù): : 0.9999

2.2    實(shí)際樣品分析結(jié)果

按照上述的實(shí)驗(yàn)方法對兩個(gè)奶粉樣品分別進(jìn)行脂肪酸的提取及甲酯化，并進(jìn)行氣相分析。根據(jù)奶粉樣品中六種脂肪酸甲酯各自的峰面積，并結(jié)合各自的校準(zhǔn)曲線，利用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，獲得不同樣品提取物中六種脂肪酸甲酯的濃度。

結(jié)果如表3所示。圖8為1#樣品的色譜分析譜圖。

圖8 1#樣品色譜分析譜圖

表3 樣品提取物中六種脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度

上述得到的結(jié)果是樣品提取物中六種脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度，根據(jù)這個(gè)結(jié)果再結(jié)合公式1即可計(jì)算出樣品中六種脂肪酸的具體含量。計(jì)算結(jié)果如表4所示。

    公式1

式中：

X_i —— 樣品中各脂肪酸的含量，單位為 mg/100g；

V —— 樣品的定容體積，單位為 mL；

m —— 樣品質(zhì)量，單位為 g；

c_i —— 試樣測定液中各脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度，單位為 mg/mL；

F_i —— 各脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化為脂肪酸的換算系數(shù)，參見附表1。

表4樣品中六種脂肪酸的含量

附表1 各脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)換成脂肪酸的系數(shù)F_i

2.3精密度實(shí)驗(yàn)

在重復(fù)性條件下進(jìn)行兩次獨(dú)立測定，根據(jù)測定結(jié)果，計(jì)算精密度。計(jì)算結(jié)果如表5所示。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用氣相色譜石英毛細(xì)柱外標(biāo)法測定奶粉中的六種脂肪酸含量。實(shí)驗(yàn)中，六種脂肪酸甲酯在各自的濃度范圍內(nèi)都有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r≥0.9992，儀器和方法均具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。對2種奶粉樣品進(jìn)行了檢測分析，得到了2種奶粉樣品中六種脂肪酸相應(yīng)的含量，并且兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果間的精密度小于15%，符合國標(biāo)要求。