10.1 有機(jī)硫殺菌劑
　　有機(jī)硫殺菌劑是指毒性基團(tuán)或成型基中含有硫的有機(jī)合成殺菌劑，是最早研制的有機(jī)殺菌劑。有機(jī)硫殺菌劑具有高效、低毒、殺菌譜廣、藥害少、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。
　　按照已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)該類(lèi)殺菌劑主要分為三種類(lèi)型：
　　1. 二硫代氨基甲酸鹽類(lèi)衍生物：是最重要的一類(lèi)有機(jī)硫殺菌劑，包括乙撐二硫代氨基甲酸鹽類(lèi)和二甲基二硫代氨基甲酸鹽類(lèi)，前者即代森類(lèi)，主要有鋅鹽、錳鹽和銨鹽等，代表品種是代森錳鋅等；后者即福美類(lèi)，如福美鐵、福美鋅等；還有非鹽的二分子二甲基二硫代氨基甲酸氧化物，如福美雙等。
　　2. 三氯甲硫基類(lèi)：含有三氯甲硫基的多種衍生物，如酰胺、酰羥銨、酰肼、醇類(lèi)、酚類(lèi)、硫醇類(lèi)、硫酚類(lèi)、磺酰胺類(lèi)、硫代磺酸類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)等。其中酰胺類(lèi)最重要，主要的品種有克菌丹和滅菌丹。
　　3. 氨基磺酸鹽和取代苯磺酸類(lèi)，如氨基磺酸鈉、敵銹鈉等。
　　10.1.1 乙撐二硫代氨基甲酸鹽類(lèi)殺菌劑
　　乙撐二硫代氨基甲酸鹽類(lèi)（Ethylenebisdithiocarbomates, EBDCs），即代森類(lèi)殺菌劑，是一類(lèi)廣泛使用的保護(hù)性殺菌劑，其主要品種有代森錳（maneb）、代森鋅（zineb）、代森錳鋅（mancozeb）、代森鈉（nanbam）、代森銨（amobam）、代森環(huán)（milneb）等。最常用的品種為代森錳鋅。
　　該類(lèi)殺菌劑主要用于防治果樹(shù)、蔬菜、西瓜等作物的葉斑病、葉霉病、霜霉病、炭疽病等。從殘留角度，人們關(guān)心其在蔬菜、水果及其在土壤環(huán)境中的殘留。由于該類(lèi)藥劑幾乎沒(méi)有內(nèi)吸作用，使用后主要?dú)埩粼谥参矬w表面，因此，殘留提取比較容易。
　　該類(lèi)殺菌劑的雜質(zhì)及其在環(huán)境中的降解產(chǎn)物乙撐硫脲（ethylenethiourea, ETU），引起試驗(yàn)動(dòng)物甲狀腺瘤，具有致癌性、致突變性和致畸性，因此乙撐二硫代氨基甲酸鹽類(lèi)殺菌劑的安全問(wèn)題受到高度重視。
　　1．頂空氣相色譜法
　　目前代森類(lèi)殺菌劑的殘留量以CS2來(lái)表示。因此，此類(lèi)殺菌劑的殘留測(cè)定的是CS2的含量。一般采用頂空氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。
　　⑴. 測(cè)定原理
　　在密閉容器內(nèi)代森類(lèi)殺菌劑與反應(yīng)分解生成二硫化碳并全部汽化進(jìn)入反應(yīng)瓶上部空間的氣相之中，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)瓶中液－氣平衡狀態(tài)下，氣相中二硫化碳的量來(lái)確定代森類(lèi)農(nóng)藥的殘留量。
　　⑵. 樣品處理
　　稱取一定量（50g）經(jīng)過(guò)粉碎的蔬菜、水果、土壤、糧食樣品或量取一定體積的水樣于反應(yīng)瓶中，反應(yīng)瓶可用250mL的醫(yī)用葡萄糖注射液瓶代替（密封要好）。加入一定量（3g）的氯化亞錫（還原劑）和一定量的10％的鹽酸溶液，立即加塞密封。將反應(yīng)瓶于70℃恒溫水浴中反應(yīng)2h（反應(yīng)中要經(jīng)常檢查氣密性），取出反應(yīng)瓶置40℃水浴中恒溫待測(cè)。用注射器吸取反應(yīng)瓶上部空間氣體，進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。
　　二硫化碳標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：每次開(kāi)機(jī)氣相色譜測(cè)定時(shí)均需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并達(dá)到線性回歸要求才能使用。于反應(yīng)瓶中加入與樣品數(shù)量相同體積或重量的蒸餾水，及一定數(shù)量的二硫化碳標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余步驟同樣品測(cè)定。
　　⑶. 氣相色譜測(cè)定
　　色譜條件一：SP7800型氣相色譜儀 ECD檢測(cè)器，1.8m×3mm玻璃柱，20% OV–101/Gas Chrom Q 100～120目。色譜柱溫度50℃、檢測(cè)器200℃，進(jìn)樣口100℃。氮?dú)猓?span lang="EN-US">>99.999%）11.6mL/min，tR：1min45s（CS2）。最小檢測(cè)量：2×10-11g。
　　色譜條件二：SP7800型氣相色譜儀 NPD檢測(cè)器，2m×3mm玻璃柱，2%QF-1+1.5% OV-17/Gas Chrom Q 80～100目。色譜柱溫度80℃、檢測(cè)器145℃，進(jìn)樣口120℃。氮?dú)猓?span lang="EN-US">>99.999%）20mL/min，空氣15mL/min，氫氣 10mL/min 。tR：29s（CS2）。最小檢測(cè)量：1.125×10-10g。
　　色譜條件三：SP7800型氣相色譜儀 FPD檢測(cè)器，2m×3mm不銹鋼柱，5%SE-30／101白色酸洗擔(dān)體，177～149μm （80～100目）。色譜柱溫度65℃、檢測(cè)器150℃，進(jìn)樣口120℃。氮?dú)猓?span lang="EN-US">>99.999%）25mL/min，氫氣85mL/min，空氣90mL/min。tR：1min（CS2）。最小檢測(cè)量：5×10-10g。
　　色譜條件四：SP7800型氣相色譜儀 FPD檢測(cè)器，2.1m×3mm不銹鋼柱，5%SE-30/GCS 880 AW DMCS,80～100目。色譜柱溫度65℃、檢測(cè)器150℃，進(jìn)樣口150℃。氮?dú)猓?span lang="EN-US">>99.999%）25mL/min，氫氣88.3kPa，空氣127.5kPa。tR：0.95min（CS2）。最小檢測(cè)量：2×10-10g。
　　色譜條件五：GC- FPD-S，2m×3mm不銹鋼柱，15%OV-101/Gas Chromsorb W AW DMCS（80～100目）。色譜柱溫度60℃、檢測(cè)器150℃，進(jìn)樣口120℃。氮?dú)猓?span lang="EN-US">>99.99%）15mL/min，氫氣160mL/min，空氣140mL/min及70 mL/min。tR：1min（CS2）。最小檢測(cè)量：1.8×10-10g。
　　2．乙撐硫脲殘留測(cè)定方法
　　乙撐硫脲（ETU）的殘留分析方法有許多，主要有GC、HPLC、TLC測(cè)定，其中以GC測(cè)定為主。由于乙撐硫脲（ETU）的極性非常強(qiáng)，蒸氣壓極低，難以用氣相色譜法直接進(jìn)行測(cè)定，主要是由于色譜峰嚴(yán)重拖尾和檢測(cè)靈敏度達(dá)不到殘留分析的要求。目前主要采用衍生后氣相色譜測(cè)定或用高效液相色譜法，一般HPLC的靈敏度往往不如GC高，所以采用衍生后GC測(cè)定的比較多。
　　氣相色譜法
　　⑴．乙撐硫脲的衍生方法
　　乙撐硫脲的氣相色譜測(cè)定需要進(jìn)行衍生化，衍生方法主要有以下幾種：
　　①. 采用芐氯（benzyl chloride）和三氟乙酸酐（thifuoroacetic anhydride）進(jìn)行衍生。
　　首先使ETU與芐氯回流反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)提取和重結(jié)晶得熔點(diǎn)為60~70℃的S-芐基ETU（S-benzyl ETU），以S-芐基ETU做為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量。在分析殘留樣品時(shí)，用甲醇提取ETU。使提取液與芐氯回流反應(yīng)為S-芐基ETU，并凈化和濃縮，然后使S-芐基ETU與三氯氟乙酸酐反應(yīng)，反應(yīng)物以GC-ECD測(cè)定，衍生過(guò)程見(jiàn)圖10-1所示。
　　圖10-1 芐氯衍生ETU反應(yīng)
　　此方法將F原子引入，在ECD檢測(cè)時(shí)靈敏度較高。用該方法測(cè)定蘋(píng)果中ETU殘留，添加濃度為0.0103~1.03mg/kg 時(shí)，ETU的平均回收率為94.7±5.9%，樣品的最小檢測(cè)濃度達(dá)到0.005mg/kg。
　　②. 采用1-溴丁烷對(duì)ETU進(jìn)行衍生。
　　在衍生時(shí)加入二甲基酰胺（dimethyformamide，DMF）和氫硼化鈉（sodium borohydride）以促進(jìn)衍生反應(yīng)的進(jìn)行。衍生后得S-丁基ETU，用GC-FPD-S進(jìn)行測(cè)定。衍生反應(yīng)式見(jiàn)圖10-2。
　　圖10-2  1-溴丁烷衍生ETU反應(yīng)
　　用此方法對(duì)蘋(píng)果、香蕉、馬鈴薯和西紅柿中的殘留量進(jìn)行測(cè)定，添加0.01~1.0 mg/kg ETU的回收率為61±13%~85±1%，樣品中ETU最小檢出濃度小于0.01 mg/kg。
　　③. 采用芐氯（benzyl chloride）和五氟苯酰氯（pentalfluorobezoyl chloride）衍生。
　　有人認(rèn)為在第一種衍生方法中，存在回收率不穩(wěn)定，而且對(duì)照樣品中有干擾峰出現(xiàn)。所以提出用五氟苯酰氯（pentalfluorobezoyl chloride）代替第一種方法中的三氟乙酸酐。該方法的反應(yīng)過(guò)程見(jiàn)圖10-3所示。
　　圖10-3  S-芐基ETU五氟苯酰化反應(yīng)
　　用此方法對(duì)大豆、蘋(píng)果、菠菜中的ETU殘留分析進(jìn)行了研究，添加0.01~1.28mg/kg ETU的回收率為93%~114%，樣品最小檢出濃度為0.005 mg/kg。
　　④. 用間-三氟甲基芐氯與ETU反應(yīng)得S-間-三氟甲基芐基ETU（產(chǎn)物Ⅰ），產(chǎn)物（Ⅰ）可進(jìn)一步與三氟乙酸酐反應(yīng)得產(chǎn)物（Ⅱ），兩種產(chǎn)物均可用GLC-ECD進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)過(guò)程見(jiàn)圖10-4所示。
　　圖10-4  間-三氟甲基芐氯與ETU衍生反應(yīng)示意圖
　　產(chǎn)物（Ⅱ）比產(chǎn)物（Ⅰ）的靈敏度有所提高。此方法對(duì)大豆、蘋(píng)果、馬鈴薯和西紅柿中添加0.01~1.0 mg/kg ETU的回收率為92.5±4.6%，最小檢出濃度為0.002 mg/kg。
　　目前，在眾多衍生方法中以用芐氯或芐溴衍生的最多，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看芐溴更容易與ETU進(jìn)行衍生。
　　⑵. 乙撐硫脲的殘留分析：衍生氣相色譜法
　　國(guó)內(nèi)分析乙撐硫脲殘留的常用衍生氣相色譜法有以下幾種：
　　方法一：
　　該方法采用溴化芐衍生后GLC－FPD-S測(cè)定，方法原理如下：
　　①. 硫芐基乙撐硫脲（S-ETU）的制備：取0.5gETU，加入溴化芐1.0mL，加入無(wú)水乙醇，回流反應(yīng)30min，用50mL 二氯甲烷轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入1M的鹽酸20mL及50mL水，振蕩分層，棄去下層。上層加入20mL10％的NaOH溶液，振蕩后加入50mL苯，充分振蕩后靜置分層，棄去下層。上層轉(zhuǎn)入另外分液漏斗中，用50mL苯再提取1次；上層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水后注入燒瓶中，濃縮結(jié)晶。此結(jié)晶再重結(jié)晶2次得熔點(diǎn)為68～69℃的S-ETU結(jié)晶。
　　②. 樣品處理：取50g樣品，于碘量瓶中，加入50mL水及100mL無(wú)水乙醇，振蕩提取30min，減壓過(guò)濾，準(zhǔn)確量取100.0mL濾液于250mL燒瓶中，加入濃度為10-4g/mL的溴化芐溶液2mL，回流反應(yīng)30min，冷卻后用100mL水轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加入1M HCI 5mL，振蕩后加入50mL二氯甲烷，充分振蕩后靜置分層，棄去下層，上層再用二氯甲烷提取1次，方法同上。加入10％的NaOH 5mL于上層溶液中，振蕩后分別用50mL二氯甲烷提取3次，二氯甲烷經(jīng)過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水后注入燒瓶，濃縮后GC-FPD-S測(cè)定。
　　③. 氣相色譜測(cè)定：SP7800型氣相色譜儀 FPD檢測(cè)器，2m×3mm玻璃柱，7% OV-17/Gas Chrom Q 80～100目。檢測(cè)溫度，柱溫230℃，檢測(cè)器230℃，進(jìn)樣口250℃。載氣：氮?dú)?span lang="EN-US"> 160 mL/min，空氣150 mL/min及70 mL/min，氫氣160mL/min。保留時(shí)間：1 min55s。
　　此方法的最小檢出量：1.25×10-10g，添加0.05、0.1和1.0 mg/kg 3個(gè)濃度ETU的回收率在96.86±5.71%～98.68±3.26％。
　　方法二：
　　①. 樣品處理：稱取50g植物樣品（蔬菜或水果，經(jīng)搗碎）、土壤（粉碎）樣品，置于250mL三角瓶中，加50mL水，100mL乙醇，振蕩30min，減壓抽濾。取100mL濾液置250mL燒瓶中，加2mL 1.443×10-4g/mL 溴化芐乙醇溶液，回流反應(yīng)30min。冷卻后用100mL水轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加5mL1mol/L鹽酸，振蕩后用2×50mL二氯甲烷提取，收集二氯甲烷提取液。再加入5mL 10% 氫氧化鈉溶液于上層中，振蕩后用3×50mL二氯甲烷萃取，合并提取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水，濃縮，定容后待測(cè)。
　　②. 氣相色譜法測(cè)定：SP7800型氣相色譜儀NPD檢測(cè)器，2m×3mm玻璃柱，2%QF-1+1.5% OV-17/Gas Chrom Q 80～100目。檢測(cè)溫度  柱溫245℃，檢測(cè)器245℃，進(jìn)樣口260℃。載氣：氮?dú)?span lang="EN-US"> 20 mL/min，空氣15 mL/min，氫氣8mL/min。保留時(shí)間：1 min24s。
　　該方法測(cè)定香蕉和土壤中乙撐硫脲，添加0.05～1mg/kg，回收率為89.2%～98.2%，最小檢出量：6.82×10-10g，最小檢出濃度：0.014mg/kg。
　　高效液相色譜法
　　方法一 ：
　　①. 樣品處理：
　　番茄提取：取50.0g番茄樣本于組織搗碎機(jī)內(nèi),加75mL水,搗碎后迅速用氨水調(diào)整勻漿液pH11～12，同時(shí)加入5g氯化鈉、5g Celite545和100mL乙醇，再混合勻漿2min以上，用布氏漏斗過(guò)濾，甲醇少量分多次沖洗樣品缸和布氏漏斗，必要時(shí)調(diào)整過(guò)濾液pH7～9，定容250mL。取定容溶液25mL于100mL蒸發(fā)瓶中加入2滴1%癸醇丙酮溶液，在30℃條件，減壓濃縮至約8mL，取下往蒸發(fā)瓶中加入10g 102白色酸洗擔(dān)體，迅速劇烈的震蕩，直到全部團(tuán)塊散開(kāi)。向蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)加75mL淋洗液乙醇/三氯甲烷（4/96, v/v），搖勻。
　　土壤提�。悍Q取50.0g土壤樣品于碘量瓶?jī)?nèi)，所加溶液同番茄，在電動(dòng)振蕩機(jī)上振蕩提取2h，其余步驟同番茄。
　　柱層析凈化：將擔(dān)體懸浮液倒入氧化鋁層析柱中，層析柱內(nèi)裝5g已活化的氧化鋁，柱下500mL蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)裝10mL水和6滴25%癸醇丙酮溶液。待75mL淋洗液的液面接近102白色擔(dān)體時(shí)，再用200mL淋洗液分4次沖洗蒸發(fā)瓶和層析柱。待淋洗液自然滴干后按上述減壓蒸餾條件濃縮淋出液約2～3mL，停止?jié)饪s加水定容5mL，待測(cè)。
　　②. 高效液相色譜法測(cè)定：LC2100型液相色譜儀，紫外檢測(cè)器（UV，波長(zhǎng)233nm）。色譜柱：25cm×4.6mm）不銹鋼柱，內(nèi)裝Spherisorb 5μ-C18。流動(dòng)相：甲醇／水 （95/5,V/V）。柱溫：40℃。流速：0.5mL/min。保留時(shí)間：約8min。該方法最小檢出量：1×10-9g，番茄和土壤中添加乙撐硫脲0.04～0.10mg/kg，回收率為88.9%～89.2% ，土壤中添加0.05～0.10mg/kg ，回收率為85.0%～91.3%。
　　方法二：
　　①. 樣品處理：
　　提取：稱取20g樣品置于250mL具塞三角瓶中，加入80mL甲醇，振蕩提取30min。提取液用布氏漏斗經(jīng)玻纖濾膜抽濾，并用30mL甲醇分多次洗滌三角瓶及濾渣，合并濾液。將合并后的提取液倒入250mL分液漏斗中，用80mL，60mL，60mL石油醚振搖洗滌三次，每次1min，靜置分層后，棄去石油醚相。將甲醇提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上（≤40℃）濃縮至約10mL。
　　液-液分配凈化：將上述濃縮提取液轉(zhuǎn)移至250mL分液漏斗中，用15mL水分?jǐn)?shù)次清洗濃縮瓶，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。加入20gKF·2H2O和0.6g氯化銨，振搖使完全溶解。用100mL×2二氯甲烷/甲醇（9:1,V/V）提取兩次，每次1min，合并萃取液并經(jīng)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾入250mL圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上（≤40℃）濃縮至1～2mL。土壤樣品可省去提取步驟，只將石油醚洗滌后的提取液經(jīng)濃縮至干，并用少量淋洗液溶解后直接進(jìn)行柱凈化。
　　柱層析凈化：在30cm（長(zhǎng)）×1.8cm（內(nèi)徑）玻璃層析柱中，依次裝入4cm厚無(wú)水硫酸鈉，4g弗羅里硅土，4g混合凈化劑及3～4cm厚無(wú)水硫酸鈉，在混合凈化劑與下層的弗羅里硅土和上層的無(wú)水硫酸鈉之間可用少量脫脂棉分隔開(kāi)。用25mL淋洗液預(yù)淋凈化柱，然后將上述濃縮液轉(zhuǎn)移到柱中，用少量淋洗液多次洗滌圓底燒瓶并轉(zhuǎn)入柱中，再用淋洗液淋洗，棄去前10mL，收集后50mL淋出液。將所收集的淋出液轉(zhuǎn)移到100mL圓底燒瓶中，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（≤40℃）濃縮至干，用流動(dòng)相甲醇/水（30:70,V/V）定容至4mL，并用Millipore專用濾膜濾器過(guò)濾后待測(cè)定。
　　②. 高效液相色譜測(cè)定：LC2100型液相色譜儀，色譜柱：Kromsil 25cm×4.6mm C18柱；溫度：室溫；流動(dòng)相：甲醇／水（30:70,V/V）；流速：0.4mL/min。波長(zhǎng)：254nm，保留時(shí)間：7.5min。該方法最低檢出濃度：0.02mg/kg；回收率：添加乙撐硫脲0.05～10.00mg/kg的回收率在83.2%～90.7%。
　　10.1.2 二甲基二硫代氨基甲酸鹽類(lèi)殺菌劑
　　該類(lèi)殺菌劑重要的品種有銨鹽、鋅鹽、鐵鹽等，目前在我國(guó)使用的主要是砷鹽中的福美砷和氧化物福美雙（thiram）。以福美雙為例介紹其在土壤及植物體內(nèi)的殘留分析方法。
　　1. 方法原理
　　樣本用丙酮－甲醇混合液提取，二氯甲烷液－液分配，弗羅里硅土－活性炭柱層析凈化，高效液相色譜法（UV）測(cè)定的殘留測(cè)定方法。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　土壤：稱取10g樣品，加50mL丙酮/甲醇（1:1,V/V），振蕩提取2h，然后用裝有無(wú)水硫酸鈉的漏斗過(guò)濾，濾渣用150mL 丙酮／甲醇（1:1,V/V） 溶液沖洗三次，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮濾液到一定體積，加入已配好的內(nèi)標(biāo)物萘，萘的體積是濾液濃縮體積的1/2，最后用甲醇／丙酮（10:1,V/V）定容，待測(cè)。
　　小麥籽粒：稱取5g樣品，加50mL丙酮／甲醇（1:1,V/V），振蕩提取2h，用30g無(wú)水硫酸鈉的漏斗過(guò)濾，濾渣用150mL丙酮／甲醇（1:1,V/V）溶液沖洗三次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮到約2mL。
　　鮮植株：稱取25g鮮植株，切碎，加75mL丙酮，振蕩提取2h，用波氏漏斗過(guò)濾，殘?jiān)��?span lang="EN-US">50mL二氯甲烷分三次洗滌，濾液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加30mL 3%氯化鈉水溶液，用3×50mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，濃縮至約2mL。
　　⑵. 柱層析凈化
　　籽粒：層析柱中依次裝入2cm厚無(wú)水硫酸鈉，6g弗羅里硅土（80～100目，用前130℃烘5h，冷卻后加5%水減活），1g活性炭（顆�；钚蕴�，層析用，鹽酸洗，煮沸1h，冷卻后洗至中性），2cm厚無(wú)水硫酸鈉，將濃縮物轉(zhuǎn)移到層析柱中，用150mL丙酮/甲醇（1:1,V/V）混合液淋洗并收集淋出液，然后濃縮到一定體積，按提取方法中的加萘方法加入一定量的萘，用甲醇/丙酮（10:1,V/V）溶液定容，待測(cè)。
　　植株：層析柱中依次裝入2cm厚無(wú)水硫酸鈉，6g弗羅里硅土，2g活性炭，1g助濾劑，2cm厚無(wú)水硫酸鈉，用150mL二氯甲烷淋洗并收集淋出液，濃縮到一定體積，按前面方法計(jì)算加入萘的量，加入萘，用甲醇/丙酮（10:1,V/V）溶液定容，待測(cè)。
　　3. 高效液相色譜測(cè)定
　　檢測(cè)器：uv2100紫外檢測(cè)器（UV，波長(zhǎng)254nm）；色譜柱：20rbax ODS柱，0.25m（長(zhǎng)）×4.6mm（內(nèi)徑）不銹鋼柱；流動(dòng)相：用等級(jí)梯度流動(dòng)相，50/50（甲醇／水）2min，55/45（甲醇／水）3 min，60/40、2 min，65/35、1 min，70/30、5 min，50/50、2 min；柱溫：45℃；保留時(shí)間：7 min12s。該方法的最小檢出量：4.9×10-10g；最低檢出濃度：0.025mg/kg；回收率：添加0.5～2.5 mg/kg的回收率植株為75.5%～93.0%；添加2.5 mg/kg，土壤回收率為88.3% ，籽粒為97.4%；變異系數(shù)：植株為6.5%～8.5% ，土壤為11.8% ，籽粒為11.4% 。
　　10.1.3 三氯甲硫基類(lèi)殺菌劑
　　以該類(lèi)殺菌劑的主要品種克菌丹（captan）為例，介紹其殘留分析方法。
　　1. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　水果、蔬菜類(lèi)：樣品置于組織搗碎機(jī)中高速搗碎后，稱取該樣品20.0g于250mL具塞三角燒瓶中，加入100mL石油醚/丙酮（4/1, V/V），振蕩30min。用布氏漏斗抽濾，以每次20mL的石油醚洗滌殘?jiān)�，洗�?span lang="EN-US">2次，濾液合并于500mL分液漏斗中。再以每次50mL 4%的硫酸鈉水溶液洗滌，洗滌2次，以除去丙酮。上層石油醚經(jīng)無(wú)水硫酸鈉柱脫水收集于250mL燒瓶中，用10mL石油醚洗滌分液漏斗及無(wú)水硫酸鈉柱,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至約5mL。
　　油脂類(lèi)：準(zhǔn)確稱取3.0g油樣，于100mL燒杯中，加入20 mL正己烷溶解油樣，將油樣移至250 mL分液漏斗中，再用15 mL正己烷分?jǐn)?shù)次洗滌燒杯并轉(zhuǎn)至分液漏斗中，加35 mL經(jīng)正己烷飽和的乙腈，振蕩1min，靜置分層。將下層液放置于另一500 mL分液漏斗中，加入100 mL 4%的硫酸鈉水溶液和100 mL正己烷，再將250 mL分液漏斗中的正己烷層用乙腈（經(jīng)正己烷飽和）提取3次，每次用乙腈25 mL，將乙腈提取液合并至500 mL分液漏斗中，輕輕振搖1 min，農(nóng)藥則轉(zhuǎn)移至正己烷中，靜置分層,棄去水相。分別用50 mL4%的硫酸鈉水溶液洗滌正己烷層兩次,棄去水相，正己烷層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉柱脫水收集于250 mL燒瓶中，用10 mL正己烷洗滌分液漏斗及無(wú)水硫酸鈉柱,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至約5 mL。
　　⑵. 凈化
　　在2cm×25cm玻璃層析柱中的底部加少許玻璃棉，再依次加入1cm高無(wú)水硫酸鈉，5g弗羅里硅土（60～80目，650℃灼燒6h，冷卻后貯于密閉容器內(nèi)備用，使用前于130℃下活化5h）和1cm高無(wú)水硫酸鈉。先以40 mL無(wú)水乙醚/石油醚（15/85, v/v）（對(duì)油脂樣品，用無(wú)水乙醚/正己烷，15/85, v/v,下同）預(yù)洗層析柱，棄掉淋出液。把濃縮的樣品液移入柱內(nèi)，以每次5 mL的石油醚或正己烷洗樣液濃縮瓶，洗滌2次，一并移入層析柱，最后以200 mL上述無(wú)水乙醚-石油醚或無(wú)水乙醚-正己烷洗脫，收集全部洗脫液，于40℃水浴上減壓蒸至約40 mL，以石油醚或正己烷定容至50 mL，供色譜分析。
　　2. 氣相色譜測(cè)定
　　色譜柱：OV-101，30m×0.53mm×1.0μｍ彈性石英毛細(xì)管柱；載氣：高純氮?dú)�，線速度：100℃時(shí)42cm/s；柱前壓：75kPa，恒壓方式；尾吹N2：60 mL/min；進(jìn)樣溫度：250℃，檢測(cè)器溫度：300℃；采用不分流進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量1?L，進(jìn)樣0.75min后吹掃。柱溫升溫程序：100℃下恒溫4min，然后以8℃/min的速率程序升溫至240℃，繼續(xù)恒溫至樣品全部流出（約20min）。該方法在油脂及果蔬中添加50、100、150?g/kg的回收率為84.6％～97.6％，取樣20.0g，定容5mL，進(jìn)樣1?L的最小檢出濃度為10.0?g/kg。
　　10.2  有機(jī)磷殺菌劑
　　10.2.1 概述
　　有機(jī)磷類(lèi)殺菌劑具有藥效高、用途廣、易分解和低殘留的特點(diǎn)，其作為殺菌劑使用始于二十世紀(jì)六十年代，具有很好的內(nèi)吸性。有機(jī)磷殺菌劑主要有三類(lèi)：
　　1. 硫代磷酸酯類(lèi)，又包括兩類(lèi)硫趕型磷酸酯和硫逐型磷酸酯。稻瘟凈（EBP）、異稻瘟凈（IBP）和敵瘟磷（edifenphos）是常見(jiàn)的硫趕型磷酸酯類(lèi)殺菌劑。硫逐型磷酸酯的代表品種是甲基立枯磷（tolclofos-methyl）。
　　2. 磷酰胺類(lèi)有機(jī)磷殺菌劑，常用的品種是三唑磷胺。
　　3. 金屬有機(jī)磷化合物，目前這類(lèi)有機(jī)磷殺菌劑只有三乙磷酸鋁（phosethyl-AI）。
　　本節(jié)以敵瘟磷為例，介紹其殘留分析方法。
　　10.2.2 敵瘟磷的殘留分析
　　1. 方法原理
　　該方法中樣品用丙酮提取，二氯甲烷液――液分配，弗羅里硅土柱層析凈化，氣相色譜法（FPD）測(cè)定。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　糧食：稱20g稻米粉，（10g稻殼、植株）放入250mL三角瓶中，加20mL水，80mL丙酮浸泡過(guò)夜，振蕩提取2h，用快速濾紙過(guò)濾，濾渣用130mL丙酮分多次淋洗，合并丙酮提取液，在60℃水浴中減壓蒸去丙酮。
　　土壤：稱60g土壤，加水30mL，丙酮100mL，振蕩提取2h，用布氏漏斗加10g Celite545助濾劑抽濾，濾渣再用60mL丙酮浸提并振蕩1h，合并兩次濾液，在60℃水浴中減壓蒸去丙酮。
　　水：量取50mL水，放入250mL分液漏斗中，加15mL氯化鈉，用3×25mL二氯甲烷提取。合并二氯甲烷液，在50℃水浴中減壓濃縮至1～2mL。
　　⑵. 凈化
　　液-液分配：將上述的提取濃縮物，轉(zhuǎn)入250mL分液漏斗中，加4g氯化鈉，25mL飽和氯化鈉水溶液用3×25mL二氯甲烷提取。合并二氯甲烷液，在50℃水浴中減壓濃縮至1～2mL。
　　柱層析：層析柱中依次裝入2cm厚無(wú)水硫酸鈉，15g弗羅里硅土（60～80目，140℃烘8h用前用5%水脫活），2cm厚無(wú)水硫酸鈉。用正己烷濕法裝柱。然后將上述濃縮液用氣流吹干，再用少量正己烷把殘留物轉(zhuǎn)到層析柱中。用乙醚／正己烷（6:4,V/V）混合液淋洗，棄去前15mL淋出液，收集后95mL淋出液，在50℃水浴中減壓濃縮至1～2mL后，再用N2流吹干，用正己烷定容后待測(cè)。
　　3. 氣相色譜測(cè)定
　　檢測(cè)器：火焰光度檢測(cè)器（FPD-P）；色譜柱：150cm（長(zhǎng)）×3.2mm（內(nèi)徑）玻璃柱；擔(dān)體：Chromsorb W HP,80～100目；固定液：10%OV-3；檢測(cè)溫度：色譜柱260℃，檢測(cè)器280℃，進(jìn)樣口280℃；載氣：氮?dú)?span lang="EN-US">（≥99.99%），80mL/min；燃燒氣：氫氣72mL/min，空氣52mL/min。保留時(shí)間1min。該方法的最小檢出量：2.4×10-10g；最低檢出濃度：糧食為0.02mg·kg-1，稻殼及植株為0.04 mg·kg-1，土壤為0.01 mg·kg-1 ,水為0.05 mg·L-1；回收率：添加0.1~0.5 mg·kg-1，糧食回收率為86.3%，植株81.3%，稻殼89.4%，土壤94.2%，田水91.0%。變異系數(shù)：稻米為8.0%，稻殼、植株為4.9%、6.0%。土壤及田水為10.2%和3.0%。
　　10.3 取代苯類(lèi)殺菌劑
　　10.3.1 概述
　　取代苯類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)特征是以苯核為母體，品種較復(fù)雜，沒(méi)有明顯的系統(tǒng)性。重要品種如：百菌清（Chlorothalonil）、五氯硝基苯（PCNB）等。
　　在殘留分析中，該類(lèi)殺菌劑結(jié)構(gòu)中多含有Cl原子，因此測(cè)定時(shí)可以考慮用GC－ECD進(jìn)行。本節(jié)主要以百菌清為代表介紹其殘留分析方法。
　　10.3.2 蔬菜、水果中百菌清的殘留分析
　　1. 方法原理及適用范圍
　　樣品中的百菌清經(jīng)提取、凈化后用具有電子捕獲檢測(cè)器的氣相色譜儀測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。百菌清含有電負(fù)性較強(qiáng)的氯原子，選用電子捕獲檢測(cè)器定量測(cè)定。折算出百菌清的含量。本方法適用于百菌清在蔬菜和水果中的殘留分析。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取：
　　稱取25g黃瓜勻漿，置于250mL錐形瓶中，加60mL丙酮及50％磷酸2mL，充分振搖2min，過(guò)濾，用20mL丙酮洗滌錐形瓶2次，濾液全部移入250mL分液漏斗中，并加入2％硫酸鈉溶液100mL，搖勻后用環(huán)己烷60mL提取三次，靜置分層后，提取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉漏斗干燥，減壓濃縮至5mL待凈化。
　　⑵. 凈化
　　將層析柱底部墊少許脫脂棉，依次裝入2cm無(wú)水硫酸鈉，7g弗羅里硅土，2cm無(wú)水硫酸鈉，敲實(shí)并成一平面。然后用15mL環(huán)己烷預(yù)淋層析柱，棄去預(yù)淋液。將濃縮的樣品提取液倒入柱中，用100mL環(huán)己烷－丁酮（20:1）混合液分4次淋洗，收集全部淋洗液，濃縮后定容，進(jìn)行氣相色譜分析。
　　3. 氣相色譜測(cè)定
　　長(zhǎng)1.5m、內(nèi)徑3mm的玻璃柱。填裝涂有1.5％OV-210的Chromosorb W HP（80～100目）；柱箱194℃，檢測(cè)器255℃，汽化室260℃；高純氮流速30mL/min。保留時(shí)間為3min41s。該方法的最小檢出量為1.2×10-12g，最小檢出濃度為0.048mg/kg，黃瓜添加0.1、1.0、5.0 mg/kg的回收率為80.8％～86.3％。
　　10.3.3 百菌清及4-羥基百菌清的殘留分析
　　1. 方法原理
　　樣品用酸性丙酮提取，乙醚提取，弗羅里硅土柱層析凈化，氣相色譜法測(cè)定百菌清。與3-甲基-1-p-甲苯三氮烯甲基化反應(yīng)，酸性氧化鋁柱層析凈化后，氣相色譜法測(cè)定4-羥基百菌清。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　稱取50g番茄勻漿液或土壤，放入300mL具塞三角瓶中，加入150mL酸化丙酮（丙酮／硫酸／水，51:1:1，V/V/V），置于振蕩器上振蕩2h，放置過(guò)夜，用布氏漏斗抽濾，用20mL丙酮洗滌瓶和殘?jiān)?span lang="EN-US">3次，合并濾液和洗液，減壓濃縮丙酮?dú)堄辔镉?span lang="EN-US">0.4mol/L硫酸氫鈉水溶液和稀硫酸調(diào)至pH4.5。定量轉(zhuǎn)移到500mL分液漏斗中，加入3×50mL石油醚劇烈振蕩以提取百菌清。水相轉(zhuǎn)移至另一分液漏斗中，石油醚相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮近2mL，再用空氣吹至微干。殘留物用淋洗液A（石油醚/二氯甲烷，4:1，V/V）溶解，并定容至25mL。
　　水相中加入15mL硫酸（濃硫酸／水，1:1,V:V），調(diào)節(jié)pH至＜2，用3×50mL石油醚／乙醚（1:1，V/V）混合醚提取4－羥基百菌清，濃縮提取液至微干，加10mL甲醇／鹽酸（3:1，V/V），再加入5mL3-甲基-1-p-甲苯三氮烯的乙醚液（0.1g 3-甲基-1-p-甲苯三氮烯溶于5mL乙醚中），放置30min，吹盡乙醚，殘留物用5mL二氯甲烷溶解。
　　⑵. 凈化
　　百菌清：層析柱底塞入脫脂棉，然后依次裝入1.5cm厚無(wú)水硫酸鈉，2g弗羅里硅土，1.5cm厚無(wú)水硫酸鈉。用10mL石油醚預(yù)淋，棄去淋出液。用移液管準(zhǔn)確吸取1mL樣品提取液（相當(dāng)于2g樣品）于層析柱中，先用30mL洗液A淋洗，棄去淋出液，再用30mL淋洗液B（正己烷/二氯甲烷/乙腈，9.7:10:0.3，V/V/V）淋洗，并收集在50mL磨口三角瓶中，減壓濃縮至微干，甲苯定容，待測(cè)。
　　4-羥基百菌清：層析柱下部塞入脫脂棉少許，然后依次裝入1.5cm厚無(wú)水硫酸鈉，4g酸性氧化鋁，1.5cm厚無(wú)水硫酸鈉。用10mL二氯甲烷預(yù)淋，棄去淋出液，將5mL含有樣品的二氯甲烷溶解物轉(zhuǎn)移到柱中，瓶子用5mL二氯甲烷洗二次，洗液也移至柱中，然后再用30mL二氯甲烷淋洗，收集淋出液，濃縮至微干，用甲苯定容，待測(cè)。
　　3. 氣相色譜測(cè)定
　　sp7800氣相色譜儀，電子捕獲檢測(cè)器（ECD，Ni63）；色譜柱：2m×3mm玻璃柱；擔(dān)體：Chromosorb W AM DMCS，80~100目；固定液：1.6％OV-17+6.4％OV-210；檢測(cè)溫度：色譜柱200℃，檢測(cè)器250℃，進(jìn)樣口225℃；載氣：高純氮?dú)?span lang="EN-US">60mL/min；保留時(shí)間：百菌清為7min，4-羥基百菌清為8min24s。該方法的最小檢出量：百菌清為1.2×10-11g，4-羥基百菌清為2.5×10-11g；最低檢出濃度：百菌清為0.002mg/kg，4-羥基百菌清為0.005mg/kg。添加百菌清0.05~5.0 mg/kg，番茄回收率為85.0~95.9％，土壤為75.3~90.4％。添加4-羥基百菌清0.0025mg/kg，番茄回收率為87.6~92.4％。
　　10.4  雜環(huán)類(lèi)殺菌劑
　　10.4.1 概述
　　雜環(huán)類(lèi)殺菌劑類(lèi)型較多，發(fā)展快，其重要的品種類(lèi)型有：
　　1. 酰苯胺類(lèi)衍生物：該類(lèi)殺菌劑的結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)酰苯胺基。又分為兩小類(lèi)，一類(lèi)是N－取代二甲亞胺類(lèi)，二類(lèi)是N－酰基－α－氨基酸類(lèi)。該類(lèi)殺菌劑包括紋枯利（菌核凈，Dimerhachlone）、菌核利（Dichlozoline）、乙烯菌核利（Vinclozolin）甲霜靈（metalaxyl）、異菌脲（Iprodione）等常見(jiàn)品種。
　　2. 丁烯酰胺衍生物：其分子結(jié)構(gòu)中含有丁烯酰胺的基本骨架，多為內(nèi)吸殺菌劑。最代表品種是萎銹靈（Oxathiin）和氧化萎銹靈（Oxycarboxin）。
　　3. 三氯乙基酰胺衍生物：品種較少，主要有嗪胺靈（Triforine）和苯胺靈（Chleraniformethane）。
　　4. 吡啶衍生物：分子中含有吡啶環(huán)，代表品種有：吡氯靈（Pyroxychlor）。
　　5. 嘧啶衍生物：結(jié)構(gòu)中含有嘧啶環(huán)，主要品種有甲菌定（Dimethirol）和乙菌定（Ethirimate）和磺菌定（Bupirimate）。
　　6. 嗎啉衍生物：分子結(jié)構(gòu)中含有嗎啉環(huán)。代表品種有：十三嗎啉（Tridemorph）、嗎菌靈（Dodemorph）和丙菌靈（Fenpropimorph）等。
　　7. 苯并咪唑衍生物：結(jié)構(gòu)中含有苯并咪唑母核。常見(jiàn)品種有：多菌靈（Carbendazim）、苯菌靈（Benomyl）、甲基托布津（Thiophanate-methy）等。
　　8. 三唑衍生物：分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)N－取代的三氮唑母核。代表品種有：三唑酮（Triadimefon）、多效唑（Paclobutrazol）、丙環(huán)唑propiconazole等。
　　9. 異噁唑及異噻唑衍生物：品種較少，主要有立枯靈（Hymexazol）等。
　　在以上類(lèi)型中吡啶類(lèi)、嘧啶類(lèi)、咪唑類(lèi)、哌嗪類(lèi)、三唑類(lèi)和嗎啉類(lèi)等六大類(lèi)又常稱為甾醇生物合成抑制劑類(lèi)。甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成部分，影響甾醇生物合成的殺菌劑會(huì)使菌體細(xì)胞膜的功能受到破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在二十世紀(jì)八十年代，甾醇生物合成抑制劑成為內(nèi)吸性殺菌劑的開(kāi)拓性的新領(lǐng)域。甾醇生物合成抑制劑具有強(qiáng)的向頂性傳導(dǎo)活性和明顯的熏蒸作用，殺菌譜廣、高效、低用量、藥效期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，所以已經(jīng)成為殺菌劑的主要品種類(lèi)型。
　　10.4.2 甲霜靈的殘留分析
　　該藥劑屬于酰苯胺類(lèi)衍生物中的N-酰基-α-氨基酸類(lèi)，其殘留分析主要有氣相色譜和高效液相色譜兩種測(cè)定方法。
　　1. 氣相色譜方法
　　⑴. 方法原理
　　樣品用甲醇振蕩提取，二氯甲烷液－液分配，酸性氧化鋁柱層析凈化、氣相色譜法（NPD）測(cè)定。
　　⑵. 樣品處理
　　①. 提取
　　將黃瓜縱向切開(kāi)，每條取1/4，組織搗碎機(jī)搗碎。稱40g勻漿后的黃瓜樣，（土樣為20g，加水10mL），放入250mL錐形瓶中，加入80mL甲醇，加塞，在振蕩機(jī)上振蕩提取1h，過(guò)濾，濾渣再用80mL甲醇提取1h，過(guò)濾，用甲醇多次沖洗濾渣，合并濾液。
　　②. 凈化
　　液－液分配：將提取液轉(zhuǎn)移到500mL分液漏斗中，加150mL水，20mL飽和氯化鈉水溶液，用2×50mL的二氯甲烷提取。提取液通過(guò)裝有無(wú)水硫酸鈉的漏斗干燥，二氯甲烷轉(zhuǎn)移到250mL圓底燒瓶中，在55℃的水浴上濃縮至2～3mL，再用氮?dú)饬鞔抵廖⒏伞?/font>
　　柱層析：玻璃層析柱中底部塞上玻璃棉，然后依次加入2cm厚無(wú)水硫酸鈉，10g酸性氧化鋁（100～200目。用前在130℃下烘12h，冷卻后，加10％水脫活），2cm厚無(wú)水硫酸鈉。用10mL的二氯甲烷將上述的濃縮物轉(zhuǎn)移到層析柱中，用石油醚/乙醚（9:1，V/V）的混合液淋洗，棄去淋出液。再用50mL石油醚/乙醚（1:1，V/V）的混合液淋洗，收集在250mL圓底燒瓶中,在55℃水浴上濃縮至近干，再用氮?dú)饬鞔蹈伞Ｓ谜�己烷溶解，定容后待測(cè)。
　　⑶. 氣相色譜測(cè)定
　　檢測(cè)器：堿火焰離子化檢測(cè)器（NPD）；色譜柱：1m（長(zhǎng)）×2mm（內(nèi)徑）玻璃柱；擔(dān)體：Chromosorb GAM，80～100目；固定液：3％PEG 20M；檢測(cè)溫度：色譜柱220℃，檢測(cè)器250℃，進(jìn)樣口250℃；載氣：氮?dú)猓?span lang="EN-US">≥99.99％），30mL/min；燃燒氣：氫氣32mL/min，空氣88mL/min；保留時(shí)間：1min12s。該方法的最小檢出量：2.7×10-10g；最低檢出濃度：黃瓜為0.013mg/kg，土壤為0.018 mg/kg�；厥章剩禾砑�0.05～0.25 mg/kg，黃瓜回收率為98.0～98.5％，土壤為94.5％。
　　2. 高效液相色譜方法
　　⑴. 方法原理
　　樣品用甲醇振蕩提取，二氯甲烷液－液分配，酸性氧化鋁柱層析凈化，高效液相色譜法測(cè)定。
　　⑵. 樣品處理
　　①. 提取
　　稱取50g切碎的葡萄樣品（土樣為20g，加水10mL），放入250mL錐形瓶中，加入70mL甲醇，加塞，在振蕩器上振蕩1h，過(guò)濾，用甲醇多次洗滌濾渣，合并濾液。
　　②. 凈化
　　液-液分配凈化：將上述提取液轉(zhuǎn)移到500mL分液漏斗中，加100mL的蒸餾水和40mL飽和氯化鈉水溶液，用3×50mL的二氯甲烷提取，提取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水，二氯甲烷轉(zhuǎn)移到250mL圓底燒瓶中，在45℃的水浴上濃縮至1～2mL，再用氮?dú)饬鞔抵廖⒏伞?/font>
　　柱層析凈化：層析柱上下兩端各放1cm厚無(wú)水硫酸鈉，中間裝填7g酸性氧化鋁（小于80目，用前在550℃下烘4h，冷卻后加入10％水脫活），用10mL石油醚預(yù)淋，再用10mL石油醚將上述濃縮液轉(zhuǎn)移至柱中，用50mL石油醚/乙醚（9:1，V/V）的混合液淋洗，棄去淋出液。再用50mL石油醚/乙醚（1:1，V/V）的混合液淋洗，收集淋出液于250mL圓底燒瓶中，在45℃的水浴上減壓濃縮至干。再用重蒸的甲醇溶解，定容后待測(cè)。
　　⑶. 高效液相色譜測(cè)定
　　檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器（UV，波長(zhǎng)220nm）；色譜柱：30cm（長(zhǎng)）×4mm（內(nèi)徑）C18不銹鋼柱；流動(dòng)相：甲醇/水（80:20，V/V）；流速：1mL/min；保留時(shí)間：5min48s。該方法的最小檢出量：1.6×10-10g；最低檢出濃度：葡萄0.08 mg/kg，土壤為0.02mg/kg；回收率：葡萄中添加甲霜靈0.1～2.0 mg/kg，回收率為79.4％～85.5％。土壤中添加0.5～2.0 mg/kg，回收率為85.5～95.8％。
　　10.4.3 乙烯菌核利的殘留分析
　　該藥劑屬于酰苯胺類(lèi)衍生物中的N－取代二甲酰亞胺類(lèi)。
　　1. 方法原理
　　樣品用丙酮提取，二氯甲烷分配，中性氧化鋁/弗羅里硅土柱層析凈化，用GC-ECD測(cè)定。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　稱取20g黃瓜搗碎樣品（或過(guò)篩土樣20g），加入50mL丙酮，振蕩提取30min，過(guò)濾，用3×30mL丙酮洗滌合并全部提取液，濃縮至約10mL。將提取液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中（內(nèi)盛2％Na2SO4水溶液50mL），用3×30mL二氯甲烷振搖液液分配，合并二氯甲烷液，并經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮至2～3mL。
　　⑵. 柱層析凈化：
　　層析柱中上下兩端各加2cm厚無(wú)水硫酸鈉，中間上部加4g弗羅里硅土（60～100目，用前經(jīng)130℃活化6h），下部加4g中性氧化鋁（100～200目，用前經(jīng)130℃活化4～6h），用30mL淋洗液（二氯甲烷/乙酸乙酯，10:1，V/V）預(yù)淋，將樣品濃縮液轉(zhuǎn)移至柱中，用60mL淋洗液淋洗，收集淋出液并濃縮，定容后待測(cè)。
　　3. 氣相色譜測(cè)定
　　檢測(cè)器：電子捕獲檢測(cè)器（ECD，Ni63）；色譜柱：25m（長(zhǎng)）×0.25mm（內(nèi)徑）毛細(xì)管柱，固定液：OV-1701；檢測(cè)溫度：色譜柱200℃，檢測(cè)器250℃，進(jìn)樣口250℃；載氣：氮?dú)猓?span lang="EN-US">≥99.99％），流速50mL/min，尾氣50mL/min；分流比：50:1；保留時(shí)間：5min49s。該方法的最小檢出量：1.0×10-11g；最低檢出濃度：黃瓜為0.005mg/kg，土壤為0.01mg/kg；回收率：黃瓜中添加0.2~5.0mg/kg，回收率為87.5~107.6％；土壤中添加0.2~1.0mg/kg，回收率為85.1~108.7％。
　　10.4.4 異菌脲的殘留分析
　　該藥劑屬于酰苯胺類(lèi)衍生物中的N－取代二甲酰亞胺類(lèi)。
　　1. 方法原理
　　水果樣品切碎并經(jīng)組織搗碎后，用丙酮振蕩提取，二氯甲烷液－液分配，弗羅里硅土柱層析凈化，GC-ECD測(cè)定。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　每次取12條香蕉樣品，分開(kāi)果皮果肉，切碎經(jīng)組織搗碎2min（為方便搗碎可加入適量蒸餾水），折稱50g蕉肉，20g蕉皮于500mL具塞磨口三角瓶中，各加100mL丙酮，2~4g助濾劑Celite545，浸泡過(guò)夜，振蕩提取30min，抽濾，殘?jiān)��?span lang="EN-US">50、40、30mL丙酮洗滌，抽濾，濾液濃縮去除丙酮。
　　⑵. 液-液分配凈化
　　濃縮液轉(zhuǎn)移到500mL分液漏斗中，加5％氯化鈉水溶液50mL，加50mL二氯甲烷，振搖1min靜止分層后收集下層二氯甲烷，上層液體再加40mL二氯甲烷提取，合并二氯甲烷濃縮至近干，待柱層析。
　　⑶. 柱層析凈化
　　層析柱中依次從下至上加入2g無(wú)水硫酸鈉，5g弗羅里硅土（用前130℃烘6h），0.5g粒狀活性炭，2g無(wú)水硫酸鈉，用40mL二氯甲烷預(yù)淋，然后將上述濃縮液用少許二氯甲烷溶解并轉(zhuǎn)移到層析柱中，再用75mL二氯甲烷／乙酸乙酯（19:1，V/V）淋洗，淋出液濃縮近干，用甲苯定容，待測(cè)。
　　3. 氣相色譜測(cè)定
　　檢測(cè)器：帶電子捕獲檢測(cè)器（ECD Ni63）；色譜柱：2m（長(zhǎng)）×3mm（內(nèi)徑）玻柱，5％SE-30/Chromosorb W AW DMCS，80~100目；檢測(cè)溫度：色譜柱260℃，檢測(cè)器350℃，進(jìn)樣口300℃；載氣：氮?dú)猓?span lang="EN-US">≥99.99％）， 30mL/min ；保留時(shí)間：1min20s。該方法的最小檢出量：2.0×10-10g；最低檢出濃度：香蕉肉0.01mg/kg，香蕉皮0.05mg/kg；回收率：添加0.1～5.0mg/kg，香蕉肉為88.2％～105.8%，香蕉皮為82.3％～103.7%。
　　10.4.5 三唑酮的殘留分析
　　該藥劑屬于三唑衍生物類(lèi)殺菌劑。本方法適用于測(cè)定糧食中三唑酮的殘留量。
　　1. 樣品處理
　　糧食：稱取30.0g粉碎過(guò)60目的樣品，置于500mL具塞三角瓶中，加80mL丙酮，20mL蒸餾水，浸泡過(guò)夜后振蕩提取1h，抽濾，殘?jiān)��?span lang="EN-US">30mL丙酮洗滌兩次，合并濾液，濃縮除去大部分丙酮。將提取液轉(zhuǎn)移到250mL分液漏斗中，依次加入50mL蒸餾水，10mL飽和氯化鈉水溶液，40mL二氯甲烷，振搖2min。下層有機(jī)相移至250mL具塞三角瓶中。水相再用20mL二氯甲烷提取一次，棄去水相，有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水后收集在燒瓶中，在40℃水浴濃縮近干。殘留物用丙酮轉(zhuǎn)移到刻度試管中，定容到5mL，供GC測(cè)定。
　　2. 氣相色譜測(cè)定
　　檢測(cè)器：NPD；色譜柱：1.6m（長(zhǎng)）×3mm（內(nèi)徑）玻柱，4％OV-17+4％OV-210/Chromosorb W AW DMCS，80～100目；檢測(cè)溫度：色譜柱220℃，檢測(cè)器290℃，進(jìn)樣口290℃；載氣：氮?dú)猓?span lang="EN-US">≥99.99％），70mL/min；燃燒氣：氫氣3.6mL/min，空氣160mL/min。該方法的最小檢出量：三唑酮2.8×10-10g，三唑醇為5×10-10g；最低檢出濃度：三唑酮為0.01mg/kg，三唑醇為0.02mg/kg；添加濃度0.04~5.0 mg/kg的回收率在84.1%~103%。
　　10.4.6 丙環(huán)唑的殘留分析
　　該藥劑屬于三唑衍生物類(lèi)殺菌劑。該方法用于小麥、植株、土壤中丙環(huán)唑的殘留量分析。
　　1. 方法原理
　　樣品用甲醇/水提取，經(jīng)液－液分配，堿性氧化鋁柱層析凈化，氣相色譜法（NPD或ECD）測(cè)定。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　稱20g小麥籽粒粉碎樣品（或20g土壤樣品，或10g植株樣品），置于500mL具塞三角瓶中，加200mL甲醇/水（8:2,V/V）混合溶液浸泡過(guò)夜，振蕩提取2h。提取液通過(guò)布氏漏斗過(guò)濾。再用2×40mL溶劑重復(fù)提取。用少量溶劑洗滌三角瓶及濾渣，合并全部濾液。
　　⑵. 液－液分配凈化
　　將上述的濾液轉(zhuǎn)入1000mL分液漏斗中，加200mL蒸餾水，50mL飽和氯化鈉水溶液，用2×75mL二氯甲烷提取2次，收集二氯甲烷相，通過(guò)裝有無(wú)水硫酸鈉的漏斗，二氯甲烷收集后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器40℃水浴上濃縮近干。
　　⑶. 柱層析凈化
　　層析柱底部塞入玻璃棉球，加入20mL石油醚，然后依次加入2cm厚無(wú)水硫酸鈉，10g堿性氧化鋁（用前650℃灼燒3h，冷卻后每100g加19g蒸餾水，在旋轉(zhuǎn)濃縮器中轉(zhuǎn)動(dòng)3h或振蕩2h，儲(chǔ)于磨口瓶中，置于干燥器內(nèi)保存），2cm厚無(wú)水硫酸鈉，待石油醚剛剛沒(méi)過(guò)硫酸鈉時(shí)，立即將上述濃縮液用2mL甲苯溶解并轉(zhuǎn)入柱中，再用2×2mL甲苯洗瓶及柱壁二次，然后用50mL石油醚/二氯甲烷（6:4，V/V）淋洗、棄去淋出液；用75mL二氯甲烷／石油醚（6:4，V/V）淋洗并收集與旋轉(zhuǎn)濃縮瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器40水浴上蒸去溶劑，改用石油醚／乙醇（1:1，V/V）溶解殘?jiān)�并�?zhǔn)確定容至2mL，待測(cè)。
　　3. 氣相色譜測(cè)定
　　檢測(cè)器：氮磷檢測(cè)器（NPD）；色譜柱：1m（長(zhǎng)）×3mm（內(nèi)徑）玻柱；擔(dān)體：Chromosorb Q，80～100目；固定液：3％Carbowax 40M；檢測(cè)溫度：色譜柱230℃，檢測(cè)器250℃，進(jìn)樣口250℃；載氣：氮?dú)猓?span lang="EN-US">≥99.99％），40mL/min；燃燒氣：氫氣3mL/min，空氣100 mL/min；保留時(shí)間：3min36s。該方法的最小檢出量：2.7×10-10g；最低檢出濃度：0.01~0.03mg/kg；回收率：添加0.1~2.0 mg/kg，回收率在90.3％~94.1％。
　　10.4.7腈苯唑的殘留分析
　　該藥劑屬于三唑衍生物類(lèi)殺菌劑。本方法適用于土壤及水果中腈苯唑的殘留分析。
　　該藥劑在環(huán)境中容易光解產(chǎn)生兩種代謝物：RH-9129和RH-9130。在殘留分析中要測(cè)定母體及代謝物。
　　1. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　稱取20g水果勻漿樣品或20g土壤樣品，加80mL甲醇（土壤需先加水10mL），振蕩30min，用60目石英砂作助濾劑抽濾，濾渣再用80mL甲醇分多次沖洗濾渣并抽濾，合并濾液。甲醇提取液中加180mL水，5mL醋酸鉛飽和溶液，25mL氯化鈉飽和溶液，搖勻，靜置，用另一抽濾漏斗墊石英砂抽濾，再用30mL二氯甲烷沖洗濾渣并抽干。將甲醇及二氯甲烷濾液轉(zhuǎn)入800mL分液漏斗中，加二氯甲烷50mL×2液-液分配，取二氯甲烷層過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水后，在60℃水浴中減壓濃縮至近干，用氮?dú)饬鞔蹈扇軇��?/font>
　　⑵. 柱層析凈化
　　濕法裝柱，層析柱上下兩端加2cm厚無(wú)水硫酸鈉，中間加8g層析用硅膠，用10mL丙酮／石油醚（1:9,V/V）混合溶液將提取液移入柱中，再用50mL丙酮/石油醚（4:6,V/V）混合溶液淋洗，收集此部分淋出液并濃縮至干，定容后待測(cè)。
　　2. 氣相色譜測(cè)定
　　檢測(cè)器：氮磷檢測(cè)器（NPD）；色譜柱：15m（長(zhǎng)）×0.53mm（內(nèi)徑）石英交聯(lián)毛細(xì)管柱，固定液為DB-35；檢測(cè)溫度：色譜柱250℃，檢測(cè)器270℃，進(jìn)樣口270℃；載氣：氮?dú)猓?span lang="EN-US">>99.99%），14mL/min；燃燒氣：氫氣4mL/min，空氣180mL/min；尾吹氣：氮?dú)?span lang="EN-US">18mL/min；保留時(shí)間：腈苯唑?yàn)?span lang="EN-US">5.33min，RH-9130為6.33min，RH-9129為6.85min。該方法的最低檢出量：1×10-10g；最低檢出濃度：0.01mg/kg；回收率：水果、土壤中添加腈苯唑、RH-9130、RH-9129 0.1~1.0mg/kg，回收率分別在82.4%~95.3%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.2%~11.6%。
　　10.5  農(nóng)用抗生素
　　10.5.1 概述
　　自從1928年發(fā)現(xiàn)青霉素，1944年發(fā)現(xiàn)鏈霉素以來(lái)，抗生素得到了很快的發(fā)展，在農(nóng)業(yè)上也得到了廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前農(nóng)用抗生素的來(lái)源已經(jīng)由單純的微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，擴(kuò)展到以微生物產(chǎn)生的活性物質(zhì)為模板，進(jìn)行生物合成或結(jié)構(gòu)改造，人工合成抗生素類(lèi)殺菌劑。目前常用的品種有井岡霉素、公主嶺霉素、滅瘟素、多抗霉素等。本節(jié)以多抗霉素為例，介紹該類(lèi)殺菌劑的殘留分析。
　　10.5.2 多抗霉素在蘋(píng)果及土壤中的殘留分析
　　1. 方法原理
　　樣品用甲醇提取，濃縮物過(guò)交換樹(shù)脂柱、活性炭柱層析凈化，最后以滅菌水定容，待測(cè)。
　　2. 主要儀器設(shè)備及主要試劑
　　高速搗碎機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、高速離心機(jī)、培養(yǎng)皿、不銹鋼圈。
　　甲醇、乙醇、苯胺、檸檬酸，均為分析純；磷酸氫二鈉、氫氧化鈉為優(yōu)級(jí)醇；滅菌水；活性炭：（1g活性炭放入100mL燒杯中，加入50mL水，煮沸3min，室溫下放置30min，慢慢傾斜出去為粒浮物）；多氧霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度1470A.M.U/mg
　　3. 樣品處理
　　蘋(píng)果：稱取100g樣本置于高速搗碎機(jī)中，加150mL甲醇，搗碎3min。抽濾，用100mL甲醇/水（7:3,V/V）洗滌濾渣，合并濾液于圓底燒瓶中，移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃水浴上濃縮近50mL，用鹽酸調(diào)節(jié)至pH2.0，高速離心15min；除去沉淀物，濾液以1.5mL/min 過(guò)20×200mm的交換樹(shù)脂柱，將20mL樹(shù)脂裝入柱子，60mL 1/5M檸檬酸／磷酸氫二鈉緩沖液（pH2.0）淋洗，再用60mL水淋洗。然后依次用60mL水1.5mL/min、1000 mL 丙酮／水（1:1,V/V）1mL/min、60 mL 水1.5mL/min淋洗此柱。棄去淋洗液。再用200 mL 0.3mol/L 鹽酸以0.7mL/min淋洗該柱。溶出Polyoxin B。用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)淋洗液至pH6.0，淋洗液以2mL/min速率通過(guò)15×200min的活性炭柱。再依次用200mL0.01%苯胺溶液、200mL水，以1.5mL/min速率淋洗。再用50mL水2mL/min、1000mL水／乙醇（59:5，V/V）1.5mL/min淋洗此柱，棄去淋出液。用200mL丙酮／水（3:2,V/V）以1.5mL/min速率淋洗，淋洗液收集于圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器40℃水浴上濃縮近干，用滅菌水定容，待生物測(cè)定。試液濃度Polyoxin B超過(guò)1AmU單位時(shí)，應(yīng)該用滅菌水稀釋。
　　土壤：稱取50g樣品放入三角瓶中，加40mL 1M磷酸氫二鉀溶液,置于振蕩器上振蕩30min，抽濾，合并濾液。用鹽酸調(diào)至pH6.0 放于冰箱中過(guò)夜（5℃），除去沉淀物。濾液以2mL/min的速率通過(guò)15×200mm活性炭柱，50mL水以1mL/min速率淋洗，棄去淋出液再用400mL丙酮/水（3:2,V/V）0.5mL/min速率淋洗，并收集于圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器40℃左右的水浴上濃縮至近干，用20mL滅菌水定容，待測(cè)。
　　4. 生物法測(cè)定
　　制備孢子懸浮液：在培養(yǎng)（28℃）7~10天的蘋(píng)果輪斑病菌（AlternaninmaliAK1-3）斜面試管內(nèi)加5mL滅菌水，用接種環(huán)輕輕劃動(dòng)斜面上的菌絲，使孢子懸浮于滅菌水中，用滅菌紗布過(guò)濾于三角瓶中制成一定濃度的孢子懸浮液。
　　平面制作：將測(cè)定用的培養(yǎng)基熔化，并冷卻至45℃左右加入適量孢子懸浮液，充分混合后迅速取5mL注入滅菌的9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿使其形成均勻帶菌培養(yǎng)基平面。
　　SH
　　UL
　　SL
　　UH
　　“SH”內(nèi)注入1A?m?u（效價(jià)）/ml標(biāo)準(zhǔn)液
　　“SL”內(nèi)注入0.5A?m?u（效價(jià)）/ml標(biāo)準(zhǔn)液
　　“UH”內(nèi)注入高濃度的試液
　　“UL”內(nèi)注入1/2高濃度試液
　　加樣：培養(yǎng)基平面凝固后，按下圖位置放置不銹鋼圈（內(nèi)徑6mm，高10mm），并注入表樣各試液。
　　恒溫培養(yǎng)：加樣后的平面培養(yǎng)基放冰箱（4℃）中，5h（讓藥劑充分?jǐn)U散）后取出，置28℃恒溫箱中培養(yǎng)38～45h，取出測(cè)量抑菌圈直徑。
　　5. 結(jié)果計(jì)算
　　將培養(yǎng)38～45h的培養(yǎng)基平面取出，精確測(cè)量抑菌圈直徑（mm，精確至0.5mm），然后按下列公式計(jì)算殘留量和回收率。
　　LogQ=
　　（UH、SH、UL、SL代表抑菌圈直徑）
　　Q＝PU/PS
　　（PU為試液高濃度的效價(jià)，單位是A·m·u/mL）
　�。�PS為標(biāo)準(zhǔn)液高濃度的效價(jià)，單位是A·m·u/mL）
　　PU=QPS（PS為1A·m·u/mL）
　　殘留量（mg/kg）=
　　校正后殘留量（mg/kg）=殘留量／回收率
　　該方法最低檢出濃度：0.05mg/kg；回收率：蘋(píng)果0.5~1.0mg/kg回收率為74~79%，土壤添加0.1～1.0mg/kg回收率為80～81%；變異系數(shù)：蘋(píng)果2.5～4.1%，土壤5.0～8.7%。