操作步驟
　　 一、 細菌的培養(yǎng)和收集
　　 將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基（含50μg/ml Amp）中, 37℃培養(yǎng)12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基（含50μg/ml Amp）中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期。
　　 二、 質(zhì)粒DNA少量快速提取
　　 質(zhì)粒DNA小量提取法對于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
　　 （一）、煮沸法
　　 1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ離心30秒。
　　 2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。
　　 3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。
　　 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml）, 渦旋振蕩3秒鐘。
　　 5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
　　 6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。
　　 7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。
　　 8、取20ml進行電泳檢查。
　　 [注意] 1. 對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。
　　 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時,細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。
　　 3. 提取的質(zhì)粒DNA中會含有RNA,但RNA并不干擾進一步實驗,如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應(yīng)等。
　　 （二）、 堿法
　　 1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。
　　 2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。
　　 3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中（需劇烈振蕩）,室溫下放置5-10分鐘。
　　 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物（千萬不要振蕩）,冰浴5分鐘。
　　 5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。
　　 6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿（1:1）,振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。
　　 7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。
　　 8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。
　　 9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。
　　 10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液（pH8.0，含20μg /ml RNaseA）中，儲于-20℃冰箱中。
　　 [注意] 1. 提取過程應(yīng)盡量保持低溫。
　　 2. 提取質(zhì)粒DNA過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。
　　 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇（一般使用等體積）,且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來,所以多數(shù)還是用乙醇。
　　 （三）、Wizard少量 DNA 純化系統(tǒng)
　　 Promega公司的Wizard少量DNA純化系統(tǒng)可快速有效的抽提質(zhì)粒DNA,整個過程只需15分鐘。提取的質(zhì)�？芍苯佑糜贒NA測序、酶切分析和體外轉(zhuǎn)錄等。
　　 該系統(tǒng)中所含試劑和柱子可以用于50次1-3ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化，試劑包括10ml細胞懸浮液，10ml細胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA純化樹脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml ）和50支Wizard微型柱。
　　 1、 1-3ml過夜培養(yǎng)細胞液4℃下 12000g離心1-2分鐘。
　　 2、去除上清液，菌體細胞懸浮于200μl 細胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。
　　 3、 加200μl 細胞裂解液, 顛倒離心管數(shù)次,直到溶液變清亮。
　　 4、加200μl 中和液,顛倒離心管數(shù)次。
　　 5、4℃下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。
　　 6、加1ml Wizard少量 DNA 純化樹脂,顛倒離心管數(shù)次以充分混勻。
　　 7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。
　　 8、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml柱洗液,并用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。
　　 9、取出微型柱置于eppendorf管中,離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。
　　 10、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μl TE（或水）于微型柱中，靜止1分鐘后，4℃下12000g離心20秒。
　　 11、丟棄微型柱，將eppendorf管中的質(zhì)粒DNA貯于4℃或-20℃冰箱。
　　 [注意] 樹脂使用前應(yīng)充分混勻,如有結(jié)晶,可將樹脂用25-37℃水浴處理10分鐘。
　　 三、質(zhì)粒DNA的大量提取和純化
　　 在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
　　 （一）、堿法
　　 1、取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的含pBS質(zhì)粒的細菌培養(yǎng)液250ml，4℃下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。
　　 2、將細菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中（此步可省略）。
　　 3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。
　　 4、將細菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細胞。
　　 5、加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴10分鐘。
　　 6、加9ml用冰預(yù)冷的溶液III, 搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時應(yīng)形成白色絮狀沉淀。
　　 7、4℃下5000g離心15分鐘。
　　 8、取上清液,加入50ml RNA酶A（10mg/ml）, 37℃水浴20分鐘。
　　 9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。
　　 10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。
　　 11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG（分子量6000）, 冰上放置60分鐘。
　　 12、4℃下12000g離心15分鐘, 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。
　　 13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。
　　 [注意] 1. 提取過程中應(yīng)盡量保持低溫。
　　 2. 加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。
　　 3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時應(yīng)先對該酶液進行熱處理（80℃ 1小時）,使DNA酶失活。
　　 （二）、Wazard大量DNA純化系統(tǒng)
　　 堿法大量提取DNA往往需要很長的時間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統(tǒng)既簡單又快速,只需要離心和真空抽干,這個系統(tǒng)可以從500ml培養(yǎng)液中在3小時以內(nèi)獲得1mg以上的高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA（200-20000bp）。該系統(tǒng)不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA溶于水或TE緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反應(yīng)，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等。
該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可以用于10次100-500ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化,試劑包括: 150ml 細胞懸浮液，150ml 細胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA純化樹脂，125ml Wizard柱子洗脫溶液和10支 Wizard帶有存儲離心管的柱子。
　　 1、100-500ml細胞培養(yǎng)液置離心管中, 22-25℃下5000g離心10分鐘, 所得細胞沉淀充分懸浮于細胞懸浮液中。
　　 2、 加15ml細胞裂解溶液并輕輕混合,可以反復(fù)倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細胞裂解完全時,溶液會變清,這一步需要20分鐘。
　　 3、 加15ml中和溶液,立即反復(fù)倒置離心管數(shù)次，并使之混勻。
　　 4、 14000g,22-25℃離心15分鐘。
　　 5、 小心地將上清液吸出并移至一個新離心管中。
　　 6、 加0.5倍體積的異丙醇,混合均勻, 14000g 22-25℃下離心15分鐘。
　　 7、 棄上清,懸浮DNA沉淀于2ml TE緩沖液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。
　　 8、 加10ml Wizard大量DNA純化樹脂溶液, 并渦旋混合。
　　 9、每一個樣品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的頭插在真空器上（Promega產(chǎn)品,與此配套）。
　　 10、將樹脂/DNA混合液轉(zhuǎn)入柱子中,真空抽取樹脂/DNA混合液。
　　 11、將樹脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脫溶液至離心管中, 對管底部的樹脂/DNA進行洗脫（柱子一邊旋轉(zhuǎn)一邊加入洗脫液），并加入柱子中。
　　 12、真空抽干所加入的洗脫。
　　 13、 再加12ml柱子洗脫液進柱子并抽干。
　　 14、 加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹脂, 柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm（1300g）離心5分鐘。
　　 15、 取出柱子，真空抽干5分鐘,再將柱子放入系統(tǒng)中所提供的離心管中，2500rpm（1300g）離心5分鐘。
　　 16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃預(yù)熱過的滅菌重蒸水或TE,1分鐘后2500rpm（1300g）離心柱子/離心管5分鐘。
　　 17、 取出柱子,離心管中溶液即為提取的質(zhì)粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子，儲存在4℃或-20℃?zhèn)溆谩?
　　 [注意] 1. 在使用之前,系統(tǒng)所提供的柱子洗脫液按1:1加入125ml 95％乙醇。
　　 2. 純化樹脂必須混勻后再用.
　　 （三）、Sephrose 2B柱純化質(zhì)粒DNA
　　 堿法提取的質(zhì)粒DNA即使用RNA酶處理,仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA污染的DNA制品時,則需進行進一步純化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B進行純化,該方法具有快速,條件溫和,重復(fù)性好,載體物質(zhì)可以再利用等優(yōu)點,因而已廣泛用于質(zhì)粒DNA純化。
　　 1、將Sepharose 2B經(jīng)含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。
　　 2、將至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase 2B柱上。
　　 3、待DNA溶液完全進入柱內(nèi)后立即在柱的上部連接含有0.1% SDS的TE（pH8.0）貯液瓶。
　　 4、以1ml流出液為1份進行收集。
　　 5、對每一管測定其OD260值,以確定哪些管中含有質(zhì)粒DNA。通常質(zhì)粒DNA在柱上流出的第一個峰中。
　　 6、合并所有含質(zhì)粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿（1:1）抽提,4℃下12000g離心2分鐘,將上層水相轉(zhuǎn)入新管。
　　 7、加入2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃下沉淀10分鐘,然后4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。
　　 8、沉淀加70%乙醇洗滌,4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。
　　 9、 沉淀真空抽干,重新溶于TE或無菌水中。
　　 [注意] 在裝柱過程中,要防止柱床中出現(xiàn)斷裂或氣泡現(xiàn)象,要使界面保持平整。對新裝成的柱,應(yīng)用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱內(nèi)的凝膠均勻。

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