梯度PCR

對(duì)于一個(gè)PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算最適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對(duì)于特殊片斷，經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能"P"出來(lái)結(jié)果，細(xì)微的變化對(duì)結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問(wèn)題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問(wèn)題——在反應(yīng)過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應(yīng)條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對(duì)于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來(lái)說(shuō)這個(gè)非常重要，因?yàn)門(mén)aq和校正酶的最佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。多次實(shí)驗(yàn)可在一臺(tái)儀器上完成，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提高效率，又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

對(duì)于帶梯度功能的PCR儀，需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性和準(zhǔn)確性，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導(dǎo)致在梯度模式下得出的最佳條件與標(biāo)準(zhǔn)模式下單獨(dú)做的結(jié)果出現(xiàn)差異。SteadySlope技術(shù)是eppendorf擁有的梯度PCR技術(shù)專利，可以同樣的溫度變化速率到達(dá)所有設(shè)定的梯度溫度，所以在梯度模式下具有恒定的溫度性。這一技術(shù)保證了在梯度模式和普通模式之間可以進(jìn)行可靠的信息傳遞，不會(huì)因?yàn)闇囟忍匦圆煌�而�?dǎo)致產(chǎn)量和特異性的變化。MJ公司沒(méi)有付專利費(fèi)而選擇在梯度模式下采用不同的降溫速率，每個(gè)梯度溫度之間的溫度曲線不同，從梯度模式向普通模式進(jìn)行轉(zhuǎn)換的可能會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。此外采用TCT（三組回路）技術(shù)的梯度PCR儀由于在梯度PCR模式下增加了一個(gè)加熱和冷卻的控制區(qū)域，保證了梯度溫度控制的精確性并使不同梯度管排間的溫度均勻性更好。

在PCR儀上增加原位PCR模塊就可以在玻片上進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增，MJ和eppendorf的PCR儀都有提供原位適配器以滿足不同需要。購(gòu)買(mǎi)配有支持原位PCR模塊的PCR儀對(duì)從事醫(yī)學(xué)研究的工作者是很值得的，一機(jī)兩用。

此外，隨著基因組高通量研究的需求的提高，各品牌都推出了多槽式高通量PCR儀，各有特長(zhǎng)：MJ有一種一拖四，就是1個(gè)主機(jī)帶4個(gè)擴(kuò)增槽，每個(gè)槽可以獨(dú)立控溫，一次可以作96x4個(gè)樣品的PCR，不過(guò)一旦出現(xiàn)問(wèn)題4個(gè)都不能用了。ABI則在原來(lái)的9700的基礎(chǔ)上推出了雙384孔的基座，一次完成384x2個(gè)樣品，使得9700的功能又?jǐn)U展到高通量領(lǐng)域而無(wú)需購(gòu)買(mǎi)新的機(jī)器，可惜兩個(gè)384槽不能獨(dú)立控溫。eppendorf則有一個(gè)控制面板，可以控制5個(gè)獨(dú)立的PCR儀，每臺(tái)機(jī)器可以聯(lián)合，而且互不影響，但是比較浪費(fèi)空間。

二、儀器的功能性和人性化設(shè)計(jì)

當(dāng)然是越簡(jiǎn)單方便的設(shè)計(jì)最符合用戶的要求。

熱蓋——現(xiàn)在的PCR儀一般均配備熱蓋，熱蓋溫度設(shè)為105℃，使樣品管頂部的溫度達(dá)到105℃左右，蒸發(fā)的反應(yīng)液就不會(huì)產(chǎn)生凝集在管蓋上而改變反應(yīng)體積，這樣用戶就無(wú)需再向反應(yīng)管內(nèi)加石蠟油，直接減少后繼反應(yīng)的麻煩。如果是旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋就要特別小心，因?yàn)閴毫Φ竭_(dá)時(shí)沒(méi)有明顯的提示，用戶需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)將熱蓋旋到合適位置，不太容易掌握。如果過(guò)松，熱蓋沒(méi)有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果；如果過(guò)緊，則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能造成熱蓋的機(jī)械故障。最新的ESP技術(shù)是指熱蓋加熱時(shí)不接觸樣品管，避免加熱樣品管導(dǎo)致非特異產(chǎn)物，等加熱到設(shè)定溫度后熱蓋下降，將樣品管壓入加熱模塊，下降時(shí)間和壓力都由電子控制。

樣品基座——PCR反應(yīng)多在0.2或者0.5的管子中進(jìn)行，多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。eppendorf有一個(gè)有趣的設(shè)計(jì)，一個(gè)槽內(nèi)帶有0.2和0.5兩種不同樣品孔，不需更換基座就可以分別使用兩種不同的反應(yīng)管，或者96孔板，加原位適配器就可以變成原位PCR了。避免了換基座的麻煩。當(dāng)然不同的反應(yīng)管不可以同時(shí)使用的，因?yàn)楦叨炔煌�，熱蓋不能作用。ABI的9700就可以更換不同的樣品槽，樣品槽系列擴(kuò)增到從0.5到標(biāo)準(zhǔn)96孔，到雙384孔板，分別適合不同的需要，相當(dāng)靈活。

軟件——新的PCR儀都比較注重程序編寫(xiě)的簡(jiǎn)易性。大屏幕，顯示實(shí)時(shí)信息，倒計(jì)時(shí)，記憶存儲(chǔ)多個(gè)程序、自動(dòng)斷電保護(hù)等都有助于實(shí)驗(yàn)室中的復(fù)雜環(huán)境使用。程序儲(chǔ)存方面，有人覺(jué)得儲(chǔ)存程序的多少似乎意義不太大，但是對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員多、PCR儀每天運(yùn)作頻繁的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，每個(gè)使用者獨(dú)立儲(chǔ)存自定義的PCR程序，確實(shí)能方便下一次的調(diào)用，會(huì)節(jié)約一些時(shí)間。

綜合考慮，一臺(tái)PCR儀選購(gòu)的關(guān)鍵還是在于用戶自己的要求，有些功能可能都用不上或很少用，用戶需要仔細(xì)斟酌，畢竟是一分錢(qián)一分貨。