【摘要】 目的采用熒光分光光度法，建立了大黃中游離蒽醌類成分含量測(cè)定的方法。方法以丙酮為溶劑，在λex =460 nm 和λem =540 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果測(cè)得游離蒽醌含量在0.25～3.0 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為F=122.81C 46.224（r=0.999 6）,最低檢測(cè)限為0.25 μg/ml，表明該法靈敏度高、重現(xiàn)性較好，且操作簡(jiǎn)便。結(jié)論該研究為測(cè)量大黃中活性成分游離蒽醌提供了一種有效可靠的分析方法。

　　【關(guān)鍵詞】 大黃； 游離蒽醌； 熒光分光光度法

　　有效成分含量是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)，現(xiàn)報(bào)道的大黃中游離蒽醌檢測(cè)方法主要有比色法、薄層色譜（TLC）法、高效液相色譜法（HPLC）、毛細(xì)管膠束電泳色譜法（MECC）及毛細(xì)管電泳色譜法（CEC）。色譜方法通常需要較長(zhǎng)的分離分析時(shí)間，與之相比光譜法具有顯而易見的快速特點(diǎn)；同時(shí)熒光分光光度法可用于藥物的微量或恒量物質(zhì)分析，并具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、試樣量少和方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，因此在藥物定量尤其是中藥有效成分檢測(cè)上的應(yīng)用日趨廣泛。已有利用熒光分光光度法測(cè)定中藥決明子中總蒽醌含量測(cè)定的報(bào)道［1］。本實(shí)驗(yàn)利用羥基蒽醌的熒光特性，在丙酮溶液中，建立了中藥大黃中游離蒽醌熒光測(cè)定的新方法。

　　1 儀器與試藥

　　1.1 儀器電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司FA1004型），KQ-500B型超聲器（昆山市超聲儀器有限公司），LD4-2型低速離心機(jī)（北京醫(yī)療離心機(jī)廠），RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海正榮生化儀器廠），970CRT熒光分光光度計(jì)（上海精密儀器有限公司）。

　　1.2 材料1，8�捕�羥基蒽醌對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），95%乙醇（沈陽市東陵區(qū)紅日化工廠）、丙酮（盛森試劑有限公司）均為分析純，大黃藥材（購(gòu)自錦州市藥材公司），水為亞沸高純?nèi)ルx子水。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇用2 ml 3.1 μg/ml的1，8�捕�羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)液在300～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)掃描，蒽醌的最大激發(fā)波長(zhǎng)（λex）為460 nm，固定該激發(fā)波長(zhǎng)，掃描得發(fā)射譜圖，得到其發(fā)射波長(zhǎng)（λem）為540 nm。結(jié)果見圖1。

　　圖1 蒽醌標(biāo)準(zhǔn)液的激發(fā)波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)（略）

　　選擇該最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)（即λex/λem=460 nm/540 nm）作為后繼測(cè)定的工作條件。

　　2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取105℃干燥至恒重的1.8�捕�羥基蒽醌2.5 mg置50 ml棕色容量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻得對(duì)照原液。精密量取對(duì)照原液0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml分別置10 ml棕色容量瓶中，用丙酮定容，以丙酮試劑為空白，在λex =460 nm 和λem=540 nm處測(cè)其溶液的熒光強(qiáng)度，結(jié)果表明溶液的熒光強(qiáng)度（IF）與溶液濃度（C）在0.25～3.0 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

　　圖2 游離蒽醌熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（略）

　　2.3 條件考察

　　2.3.1 溶劑的影響 選擇丙酮、甲醇、氯仿試劑，考察了對(duì)反應(yīng)體系的影響，結(jié)果表明樣品在丙酮中熒光強(qiáng)度大、靈敏度高，且空白溶劑在此范圍內(nèi)幾乎無熒光吸收（與文獻(xiàn)報(bào)道一致［2］），在激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為540 nm處，其拉曼光較小，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較小，圖像也較直觀，故本實(shí)驗(yàn)選用丙酮作溶劑，見圖3。

　　圖3 丙酮、甲醇、氯仿熒光效果圖（略）

　　2.3.2 放置時(shí)間對(duì)游離蒽醌熒光強(qiáng)度的影響依照分析步驟,測(cè)定放置不同時(shí)間后的1，8-二羥基蒽醌的相對(duì)熒光強(qiáng)度。結(jié)果見表1。從表1中可以看出,隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸減小，熒光強(qiáng)度在0～3 h內(nèi)基本穩(wěn)定，因此應(yīng)保證在3 h內(nèi)測(cè)定熒光。

　　表1 放置時(shí)間對(duì)游離蒽醌熒光強(qiáng)度的影響（略）

　　2.4 樣品的測(cè)定

　　2.4.1 樣品溶液的制備取攝氏60℃干燥1 h的大黃粗粉80 mg，加50 ml 95%乙醇，先在25 kHz頻率下超聲20 min，然后水浴上加熱至微沸，回流1.5 h，采用3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，取上清液，殘?jiān)�再�?0 ml 95%乙醇液加熱回流30 min，離心取上清液，合并兩次上清液，濃縮后揮去乙醇，殘?jiān)�加二次蒸餾水10 ml，1 mol/L NaOH 2滴、氯仿15 ml，分離后將水溶液于冰水浴中并加乙醚10 ml、鹽酸0.4 ml后立即密封振搖3 min，靜止分層，如此方法萃取3次合并乙醚液，揮盡乙醚后加50 ml丙酮，得樣品溶液。

　　2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)分別精密吸取樣品溶液1 ml于5個(gè)10 ml棕色容量瓶中，加丙酮定容。在λex/λem=460 nm/540 nm下測(cè)熒光強(qiáng)度。結(jié)果見表2。RSD為0.3%，表明該方法的精密度良好。

　　表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

　　2.4.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)精密稱取大黃粗粉80 mg 5份，按樣品溶液的制備項(xiàng)下的方法制備樣品液，在λex/λem=460 nm/540 nm下測(cè)熒光強(qiáng)度。結(jié)果見表3。RSD為1.5%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

　　表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

　　3 討論

　　蒽醌母核是一個(gè)具有長(zhǎng)共軛體系的化合物, 且游離蒽醌的結(jié)構(gòu)上都有多個(gè)取代基－OH，更增加了分子的π電子共軛程度，故熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；由于游離蒽醌在丙酮中的熒光強(qiáng)度較大、 穩(wěn)定性好，無干擾， 故實(shí)驗(yàn)文選定丙酮為測(cè)定溶劑。

　　研究結(jié)果表明利用熒光分光光度法測(cè)定大黃中游離蒽醌的含量， 具有取樣量小、操作簡(jiǎn)便、快速靈敏的特點(diǎn) ,可用于人體血清、尿樣中的大黃中游離蒽醌的定量分析。
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