【摘要】目的建立鮮壁虎的高效液相色譜指紋圖譜，探討不同壁虎間的相似程度。方法采用高效液相色譜法分析鮮壁虎提取液中相關(guān)物質(zhì)的保留時(shí)間和吸收強(qiáng)度，對(duì)6種壁虎樣品共有峰峰面積進(jìn)行聚類(lèi)。結(jié)果選定的色譜條件給出了較好的保留時(shí)間分布和吸收強(qiáng)度，建立起鮮壁虎的HPLC指紋圖譜，聚類(lèi)分析給出了相應(yīng)結(jié)果。結(jié)論該HPLC指紋圖譜可用于鑒定鮮壁虎，壁虎所含化學(xué)成分的多寡等因素與其品種相關(guān)。
　　
　　【關(guān)鍵詞】鮮無(wú)蹼壁虎指紋圖譜高效液相色譜法聚類(lèi)分析
　　
　　壁虎（Gekko）屬隸爬行綱有磷目蜥蜴亞目。我國(guó)現(xiàn)知有壁虎屬動(dòng)物11種［1］。其性味咸、寒，有小毒，能夠祛風(fēng)、定驚、散結(jié)、解毒，治中風(fēng)癱瘓、歷節(jié)風(fēng)痛、風(fēng)痰驚癇、瘰疬、惡瘡、破傷風(fēng)、癰瘡、胃嗝氣等癥�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為壁虎對(duì)腫瘤、結(jié)核等疾病有確切療效［2～5］。近年來(lái)對(duì)壁虎抗腫瘤作用的基礎(chǔ)研究也有所報(bào)道［6，7］。筆者應(yīng)用“壁虎散”治療肺癌等腫瘤療效顯著，且副作用很小，是潛在的可開(kāi)發(fā)利用的抗腫瘤中藥品種。由于壁虎種類(lèi)較多，它們體內(nèi)所含的有效藥物成分的種類(lèi)及含量的多寡均會(huì)有所不同。為保證研究中所用壁虎的種屬純正，建立壁虎的高效液相色譜指紋圖譜，用于對(duì)壁虎的鑒定具有重要的意義。
　　
　　1儀器與材料
　　
　　1.1儀器與試劑黃金系列通用Ⅰ型高效液相色譜儀（126型泵，166型紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，GOLD軟件；美國(guó)BECHMAN公司）；DS-1高速組織搗碎機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）。色譜純乙腈（美國(guó)Tedia公司），分析純95%乙醇。
　　
　　1.2藥材實(shí)驗(yàn)所用壁虎的物種及來(lái)源見(jiàn)表1。壁虎均于9月從產(chǎn)地購(gòu)買(mǎi)，并經(jīng)當(dāng)?shù)厮帣z所鑒定。表16種壁虎的種類(lèi)及來(lái)源（略）
　　
　　2方法和結(jié)果
　　
　　2.1色譜條件層析柱：購(gòu)自大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司（瑞士SpherigelC18填料），4.6mm×250mm，5μm粒度。流動(dòng)相：A，亞沸水；B，乙腈。梯度洗脫：0～5min，100%A，流速0.7ml/min；5～6min流速由0.7ml/min升至1ml/min；6～16min，0～10%B；16～21min，10～40%B；21～31min，40～60%B；31～46min，60～100%B；46～60min，100%B。進(jìn)樣量10μl；檢測(cè)波長(zhǎng)205nm；室溫。
　　
　　2.2供試品的制備購(gòu)買(mǎi)秋季捕捉的活壁虎，隨機(jī)選取14～15只（約50g），在容器內(nèi)放置72h，以消化、排空壁虎體內(nèi)的食物，蒸餾水清洗晾干后準(zhǔn)確稱(chēng)重，置入95％酒精致死，用搗碎機(jī)粉碎勻漿（轉(zhuǎn)速：10000/min），50ml95％酒精分兩次涮洗搗碎機(jī)，合并涮洗液以浸泡勻漿后的壁虎，不時(shí)搖動(dòng)，浸泡24h后抽濾；濾渣用50ml95％酒精再次浸泡提取，抽濾；合并兩次的提取液，定容于100ml；置-2℃冰箱內(nèi)保存；使用時(shí)，取一定量的樣品液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾；當(dāng)其溫度轉(zhuǎn)變?yōu)槭覝睾�，�?0μl進(jìn)樣分析。
　　
　　濰坊干壁虎的處理：將捕捉到的濰坊活壁虎按常規(guī)方法制成干品；取15只干壁虎，用100ml95％酒精浸泡1d（軟化），用搗碎機(jī)粉碎勻漿（轉(zhuǎn)速：10000r·min-1），用原酒精液繼續(xù)浸泡2d，提取，抽濾；濾液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，以10μl進(jìn)樣分析。
　　
　　2.3方法學(xué)考察
　　
　　2.3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定由于業(yè)界對(duì)壁虎所含的有效藥物成分尚無(wú)系統(tǒng)的研究和分析，其有效藥物成分組成和結(jié)構(gòu)尚不得而知，為了使壁虎乙醇提取液中所含有的物質(zhì)能在紫外光檢測(cè)波長(zhǎng)下被最大限度地檢出，宜選擇短波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。在選用205，210，215，220nm進(jìn)行色譜分析后，對(duì)比所得色譜圖發(fā)現(xiàn)：除色譜吸收的強(qiáng)度隨波長(zhǎng)增大而依次降低外，吸收峰的數(shù)量多寡無(wú)明顯改變，據(jù)此而確定205nm為色譜參數(shù)，用于色譜檢測(cè)。
　　
　　2.3.2流動(dòng)相及柱溫的確定實(shí)驗(yàn)表明使用空調(diào)控制室溫，在22～26℃的溫度條件下，色譜峰的保留時(shí)間沒(méi)有明顯的變化，經(jīng)5次在該溫度范圍內(nèi)的測(cè)試，結(jié)果顯示色譜峰的保留時(shí)間、峰高、峰面積數(shù)據(jù)的RSD均小于1.2%，在室溫條件下的測(cè)試結(jié)果是可靠的。經(jīng)采用不同的流動(dòng)相梯度洗脫，方法中所述的梯度是最佳方案，尤其是方法開(kāi)始的最初5min以0.7ml/min的流速進(jìn)行洗脫可使保留時(shí)間較短（3～8min）的物質(zhì)得到較好的分離，滿(mǎn)足測(cè)試的需要。
　　
　　2.3.3穩(wěn)定性考察取鮮無(wú)蹼壁虎的乙醇溶液測(cè)試品分別在0，6，12，24，36，48h不同時(shí)間進(jìn)行測(cè)試，考察色譜峰保留時(shí)間與吸收強(qiáng)度的一致性，如圖1中所標(biāo)示的各指紋峰的保留時(shí)間與吸收強(qiáng)度的RSD均小于1.1%。
　　
　　2.3.4儀器精密度實(shí)驗(yàn)在空調(diào)的設(shè)定溫度為24℃時(shí)，取測(cè)試品連續(xù)五次進(jìn)樣，圖1中各指紋峰的保留時(shí)間、峰高及峰面積的RSD均小于0.6%。
　　
　　2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取壁虎分4次制作供試品，分別進(jìn)樣。結(jié)果顯示各指紋峰的保留時(shí)間、峰高及峰面積的RSD均小于1.6%。
　　
　　2.4色譜圖中選作指紋峰的保留時(shí)間區(qū)間范圍的確定
　　
　　2.4.1壁虎95％酒精提取液的后續(xù)處理采用濰坊壁虎作抗腫瘤藥用效果研究，勻漿后的壁虎用95％酒精連續(xù)浸泡提取5次，抽濾后，合并5次提取的抽濾液，在30℃下減壓蒸餾濃縮，除去其中的乙醇，獲得帶黃色固體沉淀以及脂肪物的水液；添加一倍體積的蒸餾水后，水液經(jīng)正己烷和二氯甲烷分別各萃取4次，得黃色水溶液。水溶液在30℃下減壓蒸餾濃縮，凍干，得棕色浸膏狀物。浸膏狀物用95％酒精溶解，作硅膠柱層析，得各層析后樣品。
　　
　　2.4.2各水溶性樣品的抗腫瘤效果用各樣品以MTT法對(duì)HepG2和CT-26腫瘤細(xì)胞作體外抑瘤率實(shí)驗(yàn)。其中棕色浸膏狀物濃度為5mg/ml時(shí)，抑瘤率最高可達(dá)37%，硅膠柱層析得到的4#樣品，濃度為1mg/ml時(shí)，抑瘤率最高可達(dá)49%，棕色浸膏狀物對(duì)小鼠作體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，通過(guò)腫瘤實(shí)體稱(chēng)重對(duì)比，抑瘤率可達(dá)63%。體內(nèi)、外抑瘤實(shí)驗(yàn)均表明壁虎含活性較高的抗腫瘤有效藥物成分。
　　
　　2.4.3確定指紋峰的保留時(shí)間區(qū)間范圍通過(guò)上述各水溶性樣品進(jìn)行相同色譜條件下的色譜分析，發(fā)現(xiàn)各色譜圖中的吸收峰的保留時(shí)間均在20min以?xún)?nèi)，考慮到抗腫瘤有效成分是水溶性的（謝爽、王學(xué)美的研究也有同樣的結(jié)論［6，7］），故將保留時(shí)間在20min以?xún)?nèi)作為選取指紋峰的時(shí)間界限。
　　
　　2.5聚類(lèi)分析為進(jìn)行各種壁虎所含抗腫瘤成分的比較，對(duì)各壁虎色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類(lèi)分析。聚類(lèi)分析使用各壁虎保留時(shí)間在20min以?xún)?nèi)共有的12個(gè)吸收峰，以每個(gè)壁虎的12個(gè)吸收峰的總面積除各吸收峰的峰面積，得到如表2所示的各吸收峰的相對(duì)峰面積，以此進(jìn)行聚類(lèi)分析。聚類(lèi)分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，采用離差平方和法（Ward’smethod）及歐氏距離（Euclideandistance）。表2各壁虎共有吸收峰的相對(duì)峰面積（略）
　　
　　2.6結(jié)果
　　
　　測(cè)試所得各壁虎的HPLC色譜圖，其中濰坊壁虎的色譜圖如圖1所示。
　　
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濰坊壁虎干品的色譜圖（圖2）與鮮品的有很大的差異，故鮮品的指紋圖譜不適用于干品。
　　
　　以各鮮壁虎色譜圖中保留時(shí)間作標(biāo)記的各吸收峰為指紋峰。取其中吸收強(qiáng)度最大的（保留時(shí)間分別為5.234，5.263，5.273，5.246，5.259，5.250）吸收峰為參考峰，確定其它指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰高，以歸一化法（RAi=Ai/ΣAi）確定各指紋峰的相對(duì)峰面積。由色譜中各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰高及相對(duì)峰面積（RA），即可構(gòu)建起樣品的HPLC指紋圖譜。各鮮壁虎色譜圖中吸收峰的保留時(shí)間見(jiàn)表3。表3各壁虎HPLC指紋峰的保留時(shí)間（略）
　　
　　聚類(lèi)分析所得的樹(shù)狀關(guān)系圖見(jiàn)圖3。
　　
　　3討論
　　
　　壁虎和乙醇的選擇:為盡可能全面地研究分析壁虎體內(nèi)所含物質(zhì)的抗腫瘤活性，需要盡可能多地將壁虎所含物質(zhì)提取出來(lái)。選用乙醇是考慮到乙醇與水的互溶性，選擇鮮壁虎是因?yàn)轷r壁虎自身含水。在第一遍用乙醇浸泡壁虎勻漿物時(shí)，壁虎體內(nèi)所含的水溶性好的物質(zhì)可借助于壁虎體液與乙醇的互溶而被提取出來(lái)，當(dāng)抽濾分離后，濾渣中含水甚少，再次用乙醇浸泡濾渣時(shí)，可保證其中脂溶性良好的物質(zhì)也被提取出來(lái)。若對(duì)壁虎干品進(jìn)行同樣的處理，則干壁虎所含有的水溶性物質(zhì)就不可能被很好地提取出來(lái)。從干、鮮壁虎的色譜圖中可以看到，在梯度洗脫的前半段時(shí)間，干壁虎的吸收峰數(shù)少、吸收強(qiáng)度低，而在后半段時(shí)間內(nèi)，干、鮮壁虎的吸收峰數(shù)基本相等，但干壁虎的吸收強(qiáng)度要顯著大于鮮壁虎的。
　　
　　關(guān)于壁虎的HPLC色譜圖：鮮壁虎的乙醇提取液中所含物質(zhì)種類(lèi)繁多，在某一特定色譜條件下，不可能使所有的吸收峰都得到良好的分離，盡管在樣品洗脫的初始階段（前20min）吸收峰的分離狀況不甚理想，峰的重疊相對(duì)較為嚴(yán)重；但色譜數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性良好，可以滿(mǎn)足作為指紋圖譜的需要。
　　
　　關(guān)于相似度分析：僅從各壁虎在20min以?xún)?nèi)的吸收峰的保留時(shí)間就可發(fā)現(xiàn)，在各吸收峰的保留時(shí)間序列中，各種壁虎均有峰的缺失。按時(shí)間序列，吸收峰的總數(shù)有20個(gè)，但六種壁虎的共有峰只有12個(gè)；因此從圖譜的直觀上就可以區(qū)分出不同的壁虎。為不同壁虎的鑒定提供了依據(jù)。
　　
　　聚類(lèi)分析的結(jié)果表明6種壁虎中，G.Sw和G.A最為相似，相似度可達(dá)98.61%，當(dāng)聚為五類(lèi)時(shí)，兩者為一類(lèi)，其他壁虎各自為一類(lèi)；當(dāng)聚為四類(lèi)時(shí)，G.Sw和G.A為一類(lèi)，G.H和G.J為第二類(lèi)，G.Su和G.T各自為一類(lèi)；當(dāng)聚為兩類(lèi)時(shí)，G.Sw、G.A、G.T和G.Su為一類(lèi)，而G.H和G.J為另一類(lèi)。盡管在目前這12個(gè)共有峰尚未歸屬為某個(gè)確定的化合物，但隨著研究的深入，各吸收峰的化合物名稱(chēng)及分子結(jié)構(gòu)將一一確定；聚類(lèi)分析將提供壁虎間相互替代的思路。
　　
　　尚需解決的問(wèn)題：擬通過(guò)后續(xù)的進(jìn)一步分離純化，以獲得抗腫瘤活性成分的純品及其抗腫瘤效果，并解決指紋圖譜中各吸收峰的歸屬問(wèn)題。
　　
　　本文所介紹的壁虎HPLC指紋圖譜可用于壁虎的鑒定，聚類(lèi)分析的結(jié)果給出了不同壁虎間的相似程度。