目的建立云南松中莽草酸的高效液相色譜測定方法，以分別考察云南松的不同部位中莽草酸的含量。方法色譜柱為AgilentZorbaxXDB-C18（4.6mm×150mm，5μm），流動相為甲醇-1%磷酸水溶液（3∶97），流速為0.8ml·min-1，檢測波長為214nm，柱溫為25℃。結果莽草酸線性范圍為0.083～1.66μg，相關系數(shù)r=0.9999，平均回收率為99.12%，RSD為1.16%（n=6）。云南松不同部位均含有莽草酸成分，且含量差異較大。結論云南松中的莽草酸可以作為新的莽草酸資源加以開發(fā)利用。
　　
　　【關鍵詞】云南松;莽草酸;高效液相色譜法
　　
　　云南松PinusyunnanensisFranch.為松科松屬植物，為我西南森林資源的重要樹種[1]。松的藥用歷史始載于《名醫(yī)別錄》《本草綱目》中較為詳細地描述了松針、松塔等的產(chǎn)地、形態(tài)、功效與主治[2]，主要含萜類、黃酮類等成分�，F(xiàn)代藥理學研究證明莽草酸具有較強的抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制血小板聚集和抗HIV作用[3，4]，也是目前唯一在臨床上治療感染禽流感病毒的人的有效藥物“達菲”的基本原料[5]。莽草酸的化學合成，目前由于反應條件苛刻、成本高而難以滿足市場需求，篩選廉價的莽草酸提取原料顯得十分迫切[6]。我國云南松資源豐富。為了尋找該植物中的活性成分，綜合利用其資源，本研究首次采用HPLC法測定云南松的松針、松塔、松枝、樹皮中莽草酸含量，為有針對性地開發(fā)利用我國各地豐富的云南松資源中莽草酸提供科學依據(jù)。
　　
　　1儀器與試藥
　　
　　Agilent1100高效液相色譜儀;KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;AE240電子天秤〔（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）〕。
　　
　　莽草酸對照品（HPLC峰面積歸一化法測定純度達99%以上，成都曼斯特生物科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜醇（美國Tedia試劑公司），水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
　　
　　云南松樣品2009-08-19采集于云南省大理、漾鼻兩地，經(jīng)筆者鑒定為云南松PinusyunnanensisFranch.。
　　
　　2方法與結果
　　
　　2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性色譜柱為AgilentZorbaxXDB-C18（4.6mm×150mm，5μm），流動相為甲醇-1%磷酸水溶液（3∶97），流速為0.8ml·min-1，檢測波長為214nm，柱溫為25℃。理論塔板數(shù)按莽草酸峰計算不低于5000，與其他峰的分離度均大于1.5。對照品溶液和供試品溶液分別進樣10μl，記錄色譜圖，莽草酸的保留時間約為2.8min。見圖1。
　　
　　1.莽草酸（shikimicacid）
　　
　　圖1莽草酸對照品（A）和云南松樣品（B）的HPLC色譜圖
　　
　　2.2溶液的制備
　　
　　2.2.1對照品溶液的制備精密稱取莽草酸對照品適量，置25ml棕色容量瓶中，加重蒸水溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品貯備液（每毫升含莽草酸83μg）。
　　
　　2.2.2供試品溶液的制備精密稱取樣品1g，置具塞錐形瓶中，加重蒸水100ml，超聲處理（功率200W，頻率33kHz）90min，過濾，濾液濃縮到一定程度，定容至25ml，從中取2.5ml定容至100ml，臨用前以0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。
　　
　　2.3標準曲線的制備精密吸取莽草酸對照品貯備液（83μg·ml-1）1，6，10，15，20μl注入色譜儀中，以選定的色譜條件進行測定，記錄色譜圖及峰面積。以峰面積的積分值定量，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，并進行回歸分析，求出線性回歸方程為：Y=3834.9X 3.717，r=0.9999;結果莽草酸在0.083～1.66μg范圍內(nèi)與其峰面積的積分值呈良好的線性關系。
　　
　　2.4精密度實驗按“2.1”項下色譜條件，精密吸取莽草酸對照品10μl，重復進樣5次，測得色譜峰峰面積平均值為3187.87，RSD為0.103%，顯示精密度良好。
　　
　　2.5重復性實驗精密稱取同一批云南松松枝干燥粉末5份，按“2.3”項下操作，精密吸取10μl溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，莽草酸峰面積積分值的RSD為0.87%，顯示重復性良好。
　　
　　2.6穩(wěn)定性實驗取松枝供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下，于0，4，8，16h分別測定莽草酸峰面積，計算峰面積的RSD為1.52%，表明供試液在16h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
　　
　　2.7加樣回收實驗精密稱取已知含量的云南松松枝粉末約0.1g，共6份，分別精密加入一定量的莽草酸對照品，按供試品溶液制備及測定法操作，分別進行色譜分析。結果見表1。結果表明，其平均回收率為99.12%，RSD為1.16%，符合分析要求。
　　
　　2.8樣品測定按“2.2.2”方法制備各樣品供試液，精密吸取樣品供試液和對照品溶液各10μl，分別注入高效液相色譜儀，依法測定，按外標法計算。結果見表2表1莽草酸加樣回收率表2云南松中莽草酸的含量%
　　
　　3討論
　　
　　3.1供試品溶液的制備方法的選擇實驗中分別考察了超聲提取、加熱回流、索氏提取等方法的提取效果，以超聲提取法最為省時，提取效率最高。而超聲提取法中，又分別比較了不同的溶劑（重蒸水、甲醇、95%乙醇）、不同的超聲時間、溶劑不同體積倍量的提取效果，實驗表明以100倍量的重蒸水為提取溶劑，超聲90min，可將植物各部分中的莽草酸基本提取完全。
　　
　　3.2流動相的選擇實驗比較了甲醇-水、乙腈-水等流動相系統(tǒng)[7，8]，從分離情況和出峰時間等綜合分析選擇甲醇-1%磷酸水溶液等度洗脫為佳，且保留值適宜，柱后處理簡便、省時。
　　
　　3.3檢測波長的選擇用二極管陣列檢測器在本實驗溶劑體系條件下，分析了莽草酸對照品色譜峰和樣品中目標組分相應色譜峰的紫外光譜，結果保留值相同處紫外光譜基本一致，莽草酸在214nm處有最大吸收。待測組分與雜質(zhì)峰基本能基線分離，檢測靈敏度高，確定莽草酸檢測波長為214nm。
　　
　　目前，莽草酸主要來源于八角屬植物八角茴香等果實中[9]，但資源十分有限，無法滿足市場的需求。在禽流感病毒的肆虐下，對含有莽草酸的植物進行篩選，通過定量檢測為莽草酸提取原料建立科學的依據(jù)，具有現(xiàn)實意義和積極作用。結果表明，云南松不同部位均含有莽草酸，松針和松塔含量較高，松枝次之，樹皮含量較低，為合理地利用云南松各部位的質(zhì)量研究提供了實驗依據(jù)。云南松松針、松塔等是云南松的主要副產(chǎn)物，再生速度快，且可持續(xù)利用，較之從八角茴香中提取莽草酸，原料廣泛，開發(fā)成本低廉。由于云南松資源豐富且莽草酸含量較高，因此云南松中莽草酸的開發(fā)將有巨大的潛力。