【摘要】目的研究可見(jiàn)光及紫外光分光光度法測(cè)定夏枯草中總黃酮含量的方法。方法可見(jiàn)光分光光度法是以蘆丁為參照品,硝酸鋁作顯色劑，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定總黃酮含量；紫外光分光光度法是以蘆丁為參照品，在357nm波長(zhǎng)處測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果可見(jiàn)光法平均回收率為97.76%，紫外光法為99.10%，前者的RSD值是1.02%，后者的RSD值是0.88%。結(jié)論紫外分光光度法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，是一種較理想的測(cè)定夏枯草中總黃酮含量的方法。
　　
　　【關(guān)鍵詞】夏枯草；總黃酮；分光光度法
　　
　　Abstract：ObjectiveTodeterminethetotalflavonecontentinPrunellavulgarisL.byVISandUVSpectrophotometry.MethodsThecontrolsampleofVISSpectrophotometrywasrutin,therevealingagentwasAl（NO3）3andtheanalyzedwavelengthwas510nm.ThecontrolsampleofUVSpectrophotometrywasrutinandtheanalyzedwavelengthwas357nm.ResultsTheaveragerecoveriesofVISandUVSpectrophotometrywere97.76%and99.10%,theRSDwere1.02%and0.88%respectively.ConclusionUVspectrophotometryissimple,rapid,accurate,economicalandissuitableforcontentdeterminationoftotalflavonesinPrunellavulgarisL..
　　
　　Keywords：PrunellavulgarisL.;Totalflavones;Spectrophotometry
　　
　　中藥夏枯草為唇形科夏枯草屬植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，易栽培，資源豐富。主要含有三萜及其苷類(lèi)、苯丙素類(lèi)、甾醇及其苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、香豆素、有機(jī)酸、揮發(fā)油及其糖類(lèi)等。全草均可入藥，其味辛、微苦，性微寒，具有清火、明目、散結(jié)、消腫之功效。常用于治療頭痛、眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰腫痛、甲狀腺腫大、淋巴結(jié)結(jié)核、乳腺增生癥等疾�。�1］。目前，有關(guān)植物中黃酮類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定方法主要有分光光度法和高效液相色譜法等［2～4］，其測(cè)定夏枯草總黃酮含量的方法還未見(jiàn)報(bào)道。本文分別采用可見(jiàn)光和紫外光分光光度法測(cè)定夏枯草中總黃酮的含量，并對(duì)兩種方法進(jìn)行了比較，擬尋找出一種準(zhǔn)確而簡(jiǎn)便的測(cè)定夏枯草中總黃酮含量的方法，為合理科學(xué)開(kāi)發(fā)這一寶貴的中藥資源，深入研究其確切的藥理作用提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　
　　1器材與方法
　　
　　1.1材料
　　
　　1.1.1試劑與原料
　　
　　無(wú)水甲醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：0080-9705）；夏枯草藥材購(gòu)于廣州市藥材公司（由廣東藥學(xué)院生藥研究室鑒定），經(jīng)粉碎后過(guò)60目篩，放入60～80℃烘箱中干燥12h后，稍加冷卻，放入干燥器中備用。
　　
　　1.1.2儀器與設(shè)備
　　
　　上�；萜�6010型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；上海二分7230G可見(jiàn)光分光光度計(jì)；北京賽多利斯電子分析天平；索氏提取器；F120型粉碎機(jī)；RE52286A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等。
　　
　　1.2方法
　　
　　1.2.1藥液的制備
　　
　　精確稱(chēng)取夏枯草干粉2.5000g置于索氏提取器中，石油醚回流以除去試樣中的脂類(lèi)及色素，至提取管中呈無(wú)色。將石油醚提取后的殘?jiān)�，�?00ml無(wú)水甲醇，抽提至無(wú)色。提取液全部轉(zhuǎn)移到250ml容量瓶中，用無(wú)水甲醇定容作為實(shí)驗(yàn)用液，待測(cè)。
　　
　　1.2.2可見(jiàn)光分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制［5］精確稱(chēng)取經(jīng)120℃下干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.0mg，用無(wú)水甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用無(wú)水甲醇定容，搖勻，即得蘆丁對(duì)照品溶液（每毫升溶液含蘆丁對(duì)照品0.1mg）。
　　
　　準(zhǔn)確吸取0.1mg/ml的蘆丁對(duì)照品溶液0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00ml，分別置于25ml容量瓶中，各加甲醇至10ml，分別加5%亞硝酸鈉溶液1.00ml，搖勻，放置6min后分別加10%硝酸鋁溶液1.00ml，搖勻，放置6min，再分別加1%氫氧化鈉溶液10.00ml，并用甲醇定容至刻度，搖勻，放置15min后，以無(wú)水甲醇溶液為空白液，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)各溶液的吸光度，得回歸方程為：A=0.02093C－0.0121〔A為吸光度，C為濃度（mg/L）〕，相關(guān)系數(shù)r=0.9996。表明蘆丁對(duì)照品溶液濃度處于2～32mg/L范圍內(nèi)時(shí)，吸光度與其濃度間呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系。
　　
　　1.2.3可見(jiàn)光分光光度法回收率實(shí)驗(yàn)精確稱(chēng)取6份已知總黃酮含量的夏枯草粉末2.500g，加入一定量的蘆丁對(duì)照品，按照“1.2.1”項(xiàng)所述制得實(shí)驗(yàn)液，按照“1.2.2”項(xiàng)所述顯色并測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算總黃酮含量，按下式計(jì)算回收率。
　　
　　回收率（%）=混合后實(shí)測(cè)總黃酮含量－樣品中總黃酮的含量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)加入量×100%（1）
　　
　　1.2.4可見(jiàn)光分光光度法樣品的總黃酮含量測(cè)定分別準(zhǔn)確吸取1.00ml實(shí)驗(yàn)用液入25ml容量瓶中，按照“1.2.2”項(xiàng)所述方法顯色后，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，由回歸方程計(jì)算出樣品中總黃酮的含量。
　　
　　1.2.5紫外光分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制［6］精確稱(chēng)取在120℃干燥恒重的蘆丁對(duì)照品10.0mg于100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.100mg/ml蘆丁對(duì)照品溶液。
　　
　　精確量取上述溶液0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00ml，至于10ml量瓶中，加甲醇稀釋到刻度,搖勻，制成蘆丁含量為2～32mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以甲醇為試劑空白，在357nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，結(jié)果表明蘆丁的甲醇溶液在2～32mg/L濃度范圍符合Beer定律，吸收度與其濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其回歸方程為：A=0.0317C－0.0139〔A為吸光度，C為濃度（mg/L）〕，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。
　　
　　1.2.6紫外光分光光度法回收率實(shí)驗(yàn)精密稱(chēng)取6份已知總黃酮含量的夏枯草粉末2.500g，加入一定量的蘆丁對(duì)照品，按照“1.2.1”項(xiàng)所述制得樣品液，用甲醇稀釋樣品液，在357nm處測(cè)定吸光度A，由回歸方程計(jì)算總黃酮含量，按公式（1）計(jì)算出回收率。
　　
　　1.2.7紫外光分光光度法樣品的總黃酮含量測(cè)定分別準(zhǔn)確吸取1.00ml試驗(yàn)用液入25ml容量瓶中，用甲醇稀釋定容，在357nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，由回歸方程計(jì)算出樣品中總黃酮的含量。
　　
　　2結(jié)果
　　
　　2.1樣品的總黃酮含量測(cè)定黃酮類(lèi)化合物具有特定的紫外吸收帶，其結(jié)構(gòu)中的肉桂酰環(huán)產(chǎn)生的Ⅰ帶在300～400nm內(nèi)，而由苯甲酰環(huán)產(chǎn)生的Ⅱ帶在240～285nm內(nèi)，不同的黃酮在這兩個(gè)吸收帶的吸收強(qiáng)度不同［7］。含黃酮類(lèi)化合物的原料經(jīng)一定的方法提取純化后，可直接于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度，以蘆丁為對(duì)照品對(duì)照計(jì)算其含量［8］。本實(shí)驗(yàn)選擇蘆丁在Ⅰ帶的最大吸收波長(zhǎng)357nm作為紫外光分光光度法的測(cè)量波長(zhǎng)。
　　
　　取不同產(chǎn)地的夏枯草樣品，分別用可見(jiàn)光分光光度法和紫外光分光光度法對(duì)每個(gè)樣品平行測(cè)定6次，得各個(gè)樣品的總黃酮平均含量如表1所示。表1不同產(chǎn)地夏枯草樣品的總黃酮含量（略）
　　
　　從表1可見(jiàn)，不同產(chǎn)地的夏枯草全草的總黃酮含量有一定差異，其中以貴州貴陽(yáng)產(chǎn)夏枯草黃酮含量最高，而海南�？诋a(chǎn)夏枯草黃酮含量最低。其次，用可見(jiàn)光分光光度法測(cè)得的總黃酮含量總是比用紫外光分光光度法測(cè)得的總黃酮含量要高，這可能是因?yàn)橄目莶莸幕瘜W(xué)成分中含多種萜類(lèi)，其中相當(dāng)部分萜類(lèi)的分子結(jié)構(gòu)中含有能與鋁離子絡(luò)合顯色的酚羥基，而可見(jiàn)光分光光度法是在強(qiáng)堿性溶液與鋁離子反應(yīng)后顯色，酚羥基在該條件下能與鋁離子結(jié)合，在510nm處也容易被吸收，這樣導(dǎo)致用可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定出的結(jié)果有所偏高［9～11］。
　　
　　2.2回收率實(shí)驗(yàn)把一定量的蘆丁對(duì)照品加入已知總黃酮含量的貴州夏枯草中做回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2。表2貴州貴陽(yáng)夏枯草總黃酮回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）
　　
　　由表2可見(jiàn)，采用可見(jiàn)光分光光度法，回收率范圍為96.43%～98.96%，其RSD值為1.02%；而用紫外光分光光度法，回收率范圍為97.85%～100.06%，其RSD值為0.88%，兩者均符合定量分析的要求。
　　
　　3討論
　　
　　黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于自然界的植物當(dāng)中,具有多種生物學(xué)活性,是中藥材藥物內(nèi)的一類(lèi)重要化學(xué)成分，具有多種藥理作用,諸如抗氧化作用、消炎作用、抗癌和抗基因誘變作用等。上述實(shí)驗(yàn)表明，夏枯草中含有極為豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)，但不同產(chǎn)地的夏枯草全草中所含有的總黃酮成分存在較大的差異,這可能與藥材的生長(zhǎng)環(huán)境、采收季節(jié)、提取方法以及貯藏條件等都有一定的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，采用可見(jiàn)光分光光度法和紫外光分光光度法這兩種常規(guī)方法測(cè)定夏枯草中總黃酮的含量時(shí)，都有較好的線(xiàn)性關(guān)系。但由于紫外光分光光度法能直接測(cè)定夏枯草總黃酮的含量，不需用硝酸鋁顯色，從而能夠避免夏枯草中萜類(lèi)化合物酚羥基的干擾，方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確而又經(jīng)濟(jì)，是測(cè)定夏枯草總黃酮含量更為可取的方法，適合于各基層單位推廣采用。