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1) 免疫檢測技術用于農藥殘留的免疫檢測技術有放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA)兩種。兩種技術基本原理相同,即抗原與抗體反應形成抗原抗體復合物。RIA技術以放射性同位素作指示劑,然后用γ射線探測儀或閃爍計數(shù)器測定γ射線或β射線的放射強度。而在EIA技術中,用生物酶作標記物。酶與底物發(fā)生特異性反應,生成的產物與另一種物質產生顏色反應或使紫外吸光值發(fā)生改變,用分光光度計測定底物液吸光值變化推算出被測物濃度。RIA由于使用放射性物質,檢測設備昂貴且需要防輻射設備,并且需要專業(yè)技術人員操作,應用前景受到一定限制。EIA技術相對RIA技術具有靈敏度高,特異性強,成本低,簡便快捷,自動化程度高,檢測方法多樣并且安全等優(yōu)點。EIA技術,尤其是酶聯(lián)免疫吸附技術(ELISA),已成為目前使用最普及的免疫分析技術。我國20世紀90年代開始農藥免疫檢測技術研究,主要是ELISA方法。目前我國學者在這領域仍處于摸索階段,在分子農藥與載體蛋白的聯(lián)結,抗體的制備,ELISA檢測條件摸索和試劑盒研制等方面與國外比還有很大差距。目前國外已研制出幾十種農藥的酶免檢測試劑盒,包括有機磷、氨基甲酸酯類、硫化氨基甲酸酯、有機氯類、三嗪類、擬除蟲菊酯類及酰胺類等。
(2) 酶化學法20世紀90年代,我國學者將醫(yī)學檢驗血液中膽堿酯酶檢測原理應用于農藥殘留快速檢測。目前有速測卡法和酶抑制率法。酶化學法優(yōu)點是投資少,速度快,操作簡便。其缺點是定量不夠準確,只能測出總量,不能檢出具體農藥品種。因此酶化學法適用于批發(fā)市場篩選抽查,生產基地自查,也適用于大型儀器檢出前粗選。我國蔬菜、水果不得檢出的農藥品種,幾乎都是高毒、高殘留的有機磷類、氨基甲酸酯類殺蟲劑。因此酶化學法對快速檢測蔬菜、水果中農藥殘留,初步判斷其質量安全狀況,防止因食用蔬菜、水果而發(fā)生農藥急性中毒具有一定意義。2001年農藥殘留速測卡法和酶抑制率法被制定為國家標準推薦方法。
a、 速測卡法基本原理:膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯水解為乙酸與靛酚(呈藍色),而有機磷、氨基甲酸酯類農藥可抑制膽堿酯酶的活性,使催化水解,變色過程發(fā)生改變。由此推斷蔬菜中是否含此類農藥。檢測:選取有代表性樣品,剪切成1cm見方碎片。取5g放入帶蓋瓶中,加入10ml緩沖液,振搖50次,靜置2min,取速測卡,白色要片沾取提取液,放置10min以上,將卡對折,用手捏3min,使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應。白色藥片不變色或略有藍色,均為陽性,變?yōu)樯钏{或與空白對照卡相同為陰性。b、 酶抑制率法(分光光度法)基本原理:膽堿酯酶可使乙酰膽堿水解生成膽堿和乙酸,水解產物與顯色指示劑作用使溶液顯色。有機磷及氨基甲酸酯類農藥可以抑制膽堿酯酶活性。如果膽堿酯酶活性被完全抑制則不能使乙酰膽堿水解,不能與顯色劑作用,溶液為無色;如果活性部分被抑制,乙酰膽堿部分,溶液顏色比空白溶液淺。用分光光度計在一定波長下測定其吸光度的變化算出酶抑制率,從而推算出農藥殘留含量。抑制率用式(1)表示:I =(A0-At)/A0×100%
(1) 式中: I —— 抑制率;A0 —— 正常值(空白值)吸光度;At —— 樣品溶液吸光度。目前采用的酶有乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。底物有乙酰膽堿、丁酰膽堿、氯代乙酰膽堿及硫代乙酰膽堿等,顯色劑一般采用5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)。2. 氣象色譜法(GC)氣象色譜法具有選擇性高,分離效果好,高靈敏度等優(yōu)點,是目前采用最多的方法,約占文獻報道檢測方法70%以上。我國農殘檢測方法標準80%以上為氣相法,氣相色譜用于農藥殘留分析的檢測器主要有ECD、NPD、FPD等,色譜柱大多采用毛細管柱,檢測農藥類別有有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯及氨基甲酸酯等。
3. 高效液相色譜法(HPLC)主要用于熱穩(wěn)定性差,氣化困難的農藥殘留檢測,如除蟲脲、滅幼脲等。由于紫外檢測器與氣象色譜檢測器相比靈敏度低,主要用于少量氨基甲酸酯類農藥殘留檢測,如西維因等。熒光檢測器靈敏度雖有提高,但樣品需采用衍生化技術,樣品處理繁瑣,時間較長,且成本較高,適用農藥品種較少。4. 食品中農藥殘留快速檢測技術農藥多殘留快速檢測技術是指一次樣品處理采用一種或多種類型儀器同時進行幾十種,甚至上百種農藥殘留檢測。我國20世紀90年代末由農業(yè)部環(huán)保所引進美國農藥多殘留快速掃描檢測技術(MRSM)并結合中國國情進行了改進。該技術具有操作簡單,節(jié)省溶劑,檢測速度快,檢測靈敏度高等優(yōu)點,檢測農藥品種多達200余種。使用檢測設備為2臺氣象色譜儀,1臺高效液相色譜儀。其氣相色譜儀采用雙FPD和雙ECD檢測器及極性不同的雙柱同時測定,定量更準確,定性更可靠。目前,水果蔬菜中446種農藥多殘留測定方法和動物組織中437種農藥殘留測定方法已采用作國家推薦性方法標準。上述標準方法均采用氣象色譜-質譜聯(lián)用技術及液相色譜-串聯(lián)質譜技術。
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