生鮮牛乳中三聚氰胺的測(cè)定

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了生鮮牛乳中三聚氰胺的制樣和檢測(cè)方法，包括高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS），其中氣相色譜質(zhì)譜法為仲裁法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于生鮮牛乳中三聚氰胺的測(cè)定。

本標(biāo)準(zhǔn)中高效液相色譜法檢出限為0.1 mg/kg，氣相色譜質(zhì)譜法檢出限為0.05 mg/kg。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3 高效液相色譜法

3.1 方法提要

試樣中的三聚氰胺用1％三氯乙酸提取，離心后取部分提取液，用陽離子交換柱凈化，氨化甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈捎眉状既芤喝芙�，用配備紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜儀進(jìn)行定量測(cè)定。

3.2 試劑與材料

除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合 GB/T 6682 二級(jí)水的規(guī)定。

3.2.1 乙睛：色譜純。

3.2.2 庚烷磺酸鈉。

3.2.3 檸檬酸。

3.2.4 乙酸鉛。

3.2.5 甲醇：色譜純。

3.2.6 氨水：濃度25%－28%。

3.2.7 SPE柱：陽離子交換柱，60 mg／3 mL。

3.2.8 1％三氯乙酸：稱取10g三氯乙酸溶解于1000 mL水中，混勻。

3.2.9 5％氨化甲醇：量取5mL氨水（3.2.6），溶解于100 mL甲醇（3.2.5）中，混勻。

3.2.10 乙酸鉛溶液（22 g/L）：稱取22 g乙酸鉛（3.2.4），加水適量溶解后定容至1000 mL。

3.2.11 甲醇溶液：取甲醇（3.2.5）200 mL加水800 mL，混勻。

3.2.12 濾膜：0.45 μm。

3.2.13 流動(dòng)相：稱取2.02 g庚烷磺酸鈉（3.2.2）和2.10 g檸檬酸（3.2.3）加水溶解后稀釋至1000 mL，取該溶液900 mL加入100 mL乙腈，混勻。

3.2.14 三聚氰胺對(duì)照品（≥99.0％）。

3.2.15 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 mg/mL）：稱取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺對(duì)照品，用甲醇溶液（3.2.11）溶解并稀釋至100 mL量瓶中，貯存于0℃～8℃冰箱中，有效期1個(gè)月。

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3.2.15.1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液（3.2.15）適量，分別用甲醇溶液（3.2.11）稀釋為0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，貯存于0℃～8℃冰箱中，有效期7天。

3.3 儀器與設(shè)備

3.3.1 高效液相色譜儀，配備紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。

3.3.2 高速冷凍離心機(jī)。

3.3.3 渦旋混合器。

3.3.4 cm-12水浴氮吹儀。

3.3.5 MEDIWAX固相萃取裝置。

3.3.6 THZ-82A振蕩搖床。

3.4 測(cè)定步驟

3.4.1 提取

稱取5.0 g樣品，準(zhǔn)確加入19 mL 1％的三氯乙酸（3.2.8）溶液，加入1 mL乙酸鉛溶液（3.2.10）。振蕩提取20 min，在10000 r/min離心機(jī)上離心5 min。

3.4.2 凈化

分別用3 mL甲醇，3 mL水活化SPE柱，準(zhǔn)確移取10 mL離心上清液分次上柱，再用3 mL水和3 mL甲醇洗滌SPE柱，抽干，用3 mL 5％氨化甲醇溶液（3.2.9）洗脫，收集洗脫液，抽干，洗脫液于氮吹儀上50℃氮吹至干，加1 mL甲醇溶液（3.2.11），振蕩溶解，搖勻，過0.45 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

3.4.3 測(cè)定

3.4.3.1 液相色譜條件

色譜柱：C8柱，150×4.6 mm（i.d），5 μm，或性能相當(dāng)者；

流速：1 mL／min；

柱溫：室溫；

檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；

進(jìn)樣量：20 μL。

3.4.3.2 定量測(cè)定方法

樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間的相對(duì)偏差應(yīng)不大于2％，外標(biāo)法定量，待測(cè)樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在工作曲線范圍內(nèi)。

3.5 結(jié)果計(jì)算和表述

按照下式計(jì)算試樣中三聚氰胺的含量： nmAsVCsAX××××=……………………………………………………………………………………（1）

式中：

X－試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

A－試樣溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；

As－標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；

V－凈化后加入的甲醇溶液體積，單位為毫升（mL）；

Cs－三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

m－試樣質(zhì)量，單位為克（g）；

n — 提取稀釋倍數(shù)。

平行測(cè)定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

3.6 檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

3.6.1 靈敏度

本方法生鮮牛乳中三聚氰胺的檢出限為0.1 mg/kg。

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3.6.2 準(zhǔn)確度

本方法在0.1 mg/kg～25.0 mg/kg添加濃度的回收率為80％～120％。

3.6.3 精密度

本方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV≤10％，批間變異系數(shù)CV≤15％。

4 氣相色譜質(zhì)譜法（仲裁法）

4.1 方法提要

試樣中的三聚氰胺用1％三氯乙酸提取，經(jīng)陽離子交換柱凈化，用BSTFA+1%TMCS衍生化，用氣相色譜質(zhì)譜儀進(jìn)行定性和定量分析。

4.2 試劑與材料

4.2.1 衍生化試劑：N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+1%三甲基氯硅烷（TMCS）；

4.2.2 吡啶：色譜純；

4.2.3 其他試劑和材料同3.2.5－3.2.12；

4.2.4 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.2.16），用甲醇溶液（3.2.11）稀釋為0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

4.3 儀器與設(shè)備

4.3.1 氣相色譜質(zhì)譜儀；

4.3.2 恒溫干燥箱；

4.3.3 其它儀器同3.3.2—3.3.6。

4.4 測(cè)定步驟

按3.4.1和3.4.2進(jìn)行提取與凈化。

4.4.1 衍生化

取3.4.2的凈化液，用甲醇溶液（3.2.11）稀釋到標(biāo)準(zhǔn)工作液線性范圍內(nèi)的濃度，取400 μL置于帶蓋玻璃試管中，氮?dú)獯蹈�，加�?/span>200 μL的吡啶（4.2.2）和200 μL的BSTFA+1%TMCS（4.2.1），混勻，在70℃衍生30 min，放冷后上機(jī)測(cè)定。同時(shí)分別取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（4.2.4）400 μL，氮?dú)獯蹈�，做同步衍生�?/span>

4.4.2 測(cè)定

4.4.2.1 氣相色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：

HP-5MS，5％苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），或性能相當(dāng)者；

載氣：氦氣（He），純度≥99.999％；

流速: 1.3 mL/min；

進(jìn)樣：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1 μL，進(jìn)樣口溫度: 250ºC；

升溫程序：起始溫度為75ºC，持續(xù)1.0 min，以30ºC/min升溫至300ºC，保持2.0 min；

傳輸線溫度：280ºC；

掃描模式：選擇離子掃描；

監(jiān)測(cè)離子：99、171、327、342 m/z；

溶劑延遲: 4 min；

四極桿溫度: 150ºC；

離子源溫度: 230ºC ；

EI源轟擊能：70 eV。

4.4.2.2 定性定量方法

定性方法：樣品與標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.5%，特征離子基峰豐度與標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液相差不大于20％。

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定量方法：以342，327，171，和99峰面積之和進(jìn)行校正定量。

4.5 結(jié)果計(jì)算和表述

按照下式計(jì)算試樣中三聚氰胺的含量： 21nnmAsVCsAX×××××=……………………………………………………………………………（2）

式中：

X－試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

A－試樣溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；

As－標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；

V－凈化后加入的甲醇溶液體積，單位為毫升（mL）；

Cs－三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

m －試樣質(zhì)量，單位為克（g）；

n1 — 提取稀釋倍數(shù)；

n2 — 衍生前稀釋倍數(shù)。

平行測(cè)定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

4.6 檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

4.6.1 靈敏度

本方法生鮮牛乳中三聚氰胺的檢出限為0.05 mg/kg。

4.6.2 準(zhǔn)確度

本方法在0.05 mg/kg～2.0 mg/kg添加濃度的回收率為80％～120％。

4.6.3 精密度

本方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV≤10％，批間變異系數(shù)CV≤15％。

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附 錄 A 液相色譜圖及光譜圖

A.1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖 A.1：三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

A.2 樣品中添加三聚氰胺色譜圖

圖 A.2：樣品中添加三聚氰胺色譜圖

A.3 三聚氰胺紫外光譜圖

圖 A.3：三聚氰胺紫外光譜

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附 錄 B 氣相色譜圖及離子質(zhì)譜圖

B.1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物選擇離子色譜圖

圖 B.1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物選擇離子色譜圖

B.2 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物選擇離子質(zhì)譜圖

圖 B.2 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物選擇離子質(zhì)譜圖