單核苷酸點(diǎn)突變是作物許多重要農(nóng)藝性狀發(fā)生變異的遺傳基礎(chǔ)。單堿基的變異會(huì)導(dǎo)致氨基酸替換或蛋白質(zhì)翻譯終止, 使基因功能發(fā)生改變，從而有可能產(chǎn)生優(yōu)良的等位基因與優(yōu)異性狀。傳統(tǒng)誘變及單堿基突變篩選技術(shù)（如 TILLING）需要進(jìn)行基因組規(guī)模的篩選，耗時(shí)、耗力且鑒定到的點(diǎn)突變數(shù)目和種類有限。基因組編輯技術(shù)，特別是基于 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)，可以在基因組靶向位點(diǎn)處產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂（DSB），以人為提供的外源供體 DNA 為模板，通過(guò)同源重組（HR）介導(dǎo)的 DNA 修復(fù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的單堿基突變。然而，植物中同源重組效率目前非常低，很難以此實(shí)現(xiàn)高效的、穩(wěn)定的單堿基突變。因此，植物育種和基因功能研究迫切需要新技術(shù)來(lái)提高基因組單堿基定點(diǎn)突變的效率，以實(shí)現(xiàn)基因功能與農(nóng)藝性狀的定向改良。
中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組致力于作物基因組編輯方法的研究和應(yīng)用。在前期工作基礎(chǔ)上，借鑒哺乳動(dòng)物單堿基編輯方法，高彩霞研究組利用 Cas9 變體（nCas9-D10A）融合大鼠胞嘧啶脫氨酶（rAPOBEC1）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI），構(gòu)成了高效的植物單堿基編輯系統(tǒng) nCas9-PBE，成功地在三大重要農(nóng)作物（小麥、水稻和玉米）基因組中實(shí)現(xiàn)高效、精確的單堿基定點(diǎn)突變。通過(guò)在原生質(zhì)體中對(duì)報(bào)告基因 BFP 以及三種作物中五個(gè)內(nèi)源基因七個(gè)位點(diǎn)突變結(jié)果的詳細(xì)分析, 發(fā)現(xiàn) nCas9-PBE 可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶位點(diǎn) DNA 的 C 至 T 替換，C 堿基脫氨化的窗口覆蓋靶序列的 7 個(gè)核苷酸（距離 PAM 遠(yuǎn)端的第 3- 9 位）；其中單個(gè) C 的替換效率為 0.39-7.07%，多個(gè) C 的替換效率高達(dá) 12.48%。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，利用該體系獲得了靶標(biāo)區(qū)域單堿基替換的小麥、水稻和玉米突變植株，突變效率最高可達(dá) 43.48%。nCas9-PBE 技術(shù)無(wú)需在基因組的靶位點(diǎn)產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂（DSB），也無(wú)需供體 DNA 的參與，具有簡(jiǎn)單、廣適、高效的特點(diǎn)。nCas9-PBE 單堿基編輯系統(tǒng)成功建立和應(yīng)用，為高效和大規(guī)模創(chuàng)制單堿基突變體提供了一個(gè)可靠方案，為作物遺傳改良和新品種培育提供了重要技術(shù)支撐。
該研究成果于 2016 年 10 月 31 日投稿，經(jīng)嚴(yán)格的同行評(píng)議，2017 年 2 月 5 日被正式接受，2017 年 2 月 27 日在線發(fā)表于 Nature Biotechnology 雜志 (doi:10.1038/nbt.3811)。高彩霞研究組的博士生宗媛和王延鵬為該論文的共同第一作者。該研究得到科技部，農(nóng)業(yè)部，中科院以及國(guó)家自然基金委的資助。
