酶的生產(chǎn)與分離純化

 主要內(nèi)容：

            2.1 國內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀

            2.2 酶的發(fā)酵技術(shù)

            2.3 酶的分離純化

            2.4 酶分離、純化的評(píng)價(jià)

            2.5 酶的劑型與保存

2.1國內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1.1 ．新技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用：

w  三種方法：

n  組織提�。耗竟系鞍酌�、凝乳蛋白酶

n  微生物發(fā)酵：最大量的來源

n  化學(xué)及生物合成：生物重組

w  高新技術(shù)的應(yīng)用：酶的修飾、固定化、基因重組、膜分離技術(shù)、冷凍干燥、微膠囊

2.1.3.  品種、規(guī)模不斷擴(kuò)大

w 目前30多家600多個(gè)品種，應(yīng)用于18個(gè)工業(yè)領(lǐng)域。

w 我國2000年酶制劑產(chǎn)量為30萬噸，100家，市場(chǎng)份額僅占5%，以未經(jīng)除菌去渣的粗制品粉狀酶為主。

w 國際以液體、顆粒為主。

w 國內(nèi)糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大類占了97%，顯然不合理。

w 重要產(chǎn)品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國內(nèi)尚未投入生產(chǎn);

w 我國有7家上市公司介入酶制劑開發(fā)生產(chǎn)。

2.1.4.  應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大：

w 美國酶制劑年產(chǎn)值6.25億美元，食品工業(yè)占62%，拓展飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化學(xué)工業(yè)。

2.2  酶的發(fā)酵技術(shù)

w 利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)是：

n （1） 微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。

n （2） 微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。

n （3） 微生物培養(yǎng)基來源廣泛、價(jià)格便宜。

n （4） 可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高。

n （5） 可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開發(fā)新酶種。因此，下面將主要介紹微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的一般原理和工藝。

2.2.1  產(chǎn)酶微生物

w 菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的重要條件。菌種不僅與產(chǎn)酶種類、產(chǎn)量密切相關(guān)，而且與發(fā)酵條件、工藝等關(guān)系密切。已經(jīng)在自然界中發(fā)現(xiàn)的酶有數(shù)千種，目前投入工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的酶約有50～60種。它們的生產(chǎn)菌種十分廣泛，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。

2.2.2  酶的發(fā)酵技術(shù)

w 2.2.2.1 培養(yǎng)基

n  培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無機(jī)鹽、生長因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。

（1）碳源

w  碳素是構(gòu)成菌體成分的主要元素，也是細(xì)胞貯藏物質(zhì)和生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物的骨架，還是菌體生命活動(dòng)的能量的主要來源。當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能利用有機(jī)碳 的異養(yǎng)型微生物。有機(jī)碳的主要來源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。此外，以石油產(chǎn)品中12 ～16 碳的成分來作碳源，如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂酶，均已獲得成功。

n  不同的細(xì)胞對(duì)各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇合適的碳源。另外，選擇碳源除考慮營養(yǎng)要求外，還要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導(dǎo)作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。

n 例如，α－淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)該選用有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對(duì)該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。

w （2）氮源

n  氮是生物體內(nèi)各種含氮物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機(jī)氮源和無機(jī)氮 源兩種，常用的有機(jī)氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無機(jī)氮源有：（NH4）2SO4 、NH4Cl 、NH4NO3 、（NH4）3P04 、尿素等。

n  不同的細(xì)胞對(duì)各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進(jìn)行選擇和配制。一般來說，動(dòng)物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞主要要求無機(jī)氮。多數(shù)情況下將有機(jī)氮源和無機(jī)氮源配合使用才能取得較好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生產(chǎn)，只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時(shí)，酶產(chǎn)量僅為有胨時(shí)的30% 。只用有機(jī)氮源而不用無機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)量也低，故一般除使用高濃度有機(jī)氮源外尚需添加1%~3% 的無機(jī)氮源。

w （3） 碳氮比

n  在微生物酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例是隨生產(chǎn)的酶類、生產(chǎn)菌株的性質(zhì)和培養(yǎng)階段的不同而改變的。

n  一般蛋白酶 （ 包括酸性、中性和堿性蛋白酶）  生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利，例如黑曲霉3.350 酸性蛋白酶生產(chǎn)采用由豆餅粉3.75 % 、玉米粉0.625% 、魚粉0.625% 。NH4Cl 1% 、CaCl2 0.5% 、Na2HP04 0.2% 、豆餅石灰水解液10% 組成的培養(yǎng)基；  

n  淀粉酶（ 包括α －淀粉酶、糖化酶、β －淀粉酶等） 生產(chǎn)的碳氮比一般比蛋白酶生產(chǎn)略高，例如枯草桿菌TUD127α －淀粉酶生產(chǎn)采用由豆餅粉4 % 、玉米粉8 % 、Na2HP04 0.8% 、 （NH4）2SO4 0.4% 、CaCl2 0.2% 組成的培養(yǎng)基。而在淀粉酶生產(chǎn)中糖化酶生產(chǎn)培養(yǎng)基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶生產(chǎn)培養(yǎng)基碳氮比的一般規(guī)律，但是由于菌種很多而其性質(zhì)各異。很難說都是符合上述規(guī)律的。

n  在微生物酶生產(chǎn)過程中，培養(yǎng)基的碳氮比也因培養(yǎng)過程不同而異。例如種子培養(yǎng)時(shí)，為了適應(yīng)菌體生長繁殖的需要，要求提供合成細(xì)胞蛋白質(zhì)的氮多些，容易利用的氮源的比例大些，種子培養(yǎng)基的碳氮比一般要比發(fā)酵培養(yǎng)基低些。發(fā)酵時(shí)，不同發(fā)酵階段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草桿菌BF －7658 生產(chǎn)α －淀粉酶的發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)降低，以利菌體生長繁殖，發(fā)酵中后期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)提高，以促進(jìn)淀粉酶的生成。

w （4） 無機(jī)鹽

n 微生物酶生產(chǎn)和其他微生物產(chǎn)品生產(chǎn)一樣，培養(yǎng)基中需要有磷酸鹽及硫、鉀、鈉、鈣、鎂等元素存在。在酶生產(chǎn)中常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽作為磷源，以硫酸鎂為硫源和鎂源。鈣離子對(duì)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶的活性有十分重要的穩(wěn)定作用，例如在無Ca2+存在時(shí)灰色鏈霉菌中性蛋白酶只在pH7~7.5很小范圍內(nèi)穩(wěn)定，當(dāng)有Ca2+存在時(shí)穩(wěn)定pH范圍可以擴(kuò)大到5～7。鈉離子有控制細(xì)胞滲透壓使酶產(chǎn)量增加的作用，酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基中有時(shí)以磷酸氫二鈉及硝酸鈉等形式加入，例如米曲霉α－淀粉酶生產(chǎn)，添加適量的硝酸鈉以促進(jìn)酶生產(chǎn)。

n 在天然培養(yǎng)基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉為碳源時(shí)，添加100 ppm Co2+和Zn2+，放線菌166蛋白酶活力可增加70%～80%。