摘要：由于藥物對(duì)映體之間在藥理、毒理及吸收等方面存在較大差異，因此，建立分離和測(cè)定對(duì)映體化合物的方法十分重要。本文綜述HPLC法在分離和測(cè)定藥物對(duì)映體的常用方法，包括手性衍生化試劑、手性流動(dòng)相和手性固定相在藥物對(duì)映體分離測(cè)定中的應(yīng)用。對(duì)對(duì)映體化合物的分析鑒定有指導(dǎo)意義。

　　手性化合物的拆分是當(dāng)前分析化學(xué)中最為活躍的領(lǐng)域之一，自然界中的許多化合物都是有旋光性的，而合成手性藥物中大多（88%）是外消旋體，許多手性藥物的對(duì)映體在生理過(guò)程中顯示了不同生理活性。據(jù)研究反應(yīng)停的致畸作用主要是由于其（S）-（-）異構(gòu)體所致。因此，建立高專(zhuān)屬性、高靈敏度、高分離度的對(duì)映體拆分和測(cè)定方法，對(duì)提高藥物的活性、減小副作用，深入研究藥物的作用機(jī)理等具有重要的理論和實(shí)際意義。

　　對(duì)映體化合物之間除對(duì)偏振光的偏轉(zhuǎn)方向不同外，具有完全相同的理化性質(zhì)，因而其分離比較困難。傳統(tǒng)的拆分方法有分步結(jié)晶、微生物和酶消化法等，或者用手性衍生化試劑將其轉(zhuǎn)化成非對(duì)映體，然后根據(jù)其物理性質(zhì)不同進(jìn)行分離，但這些方法難于進(jìn)行微量的分離和測(cè)定。80年代以來(lái)，隨著快速、準(zhǔn)確、微量的光學(xué)異構(gòu)體的HPLC拆分及測(cè)定方法的建立和發(fā)展，使HPLC迅速成為藥物對(duì)映體分離和測(cè)定最為廣泛應(yīng)用的方法。

　　手性HPLC拆分法是以現(xiàn)代HPLC技術(shù)為基礎(chǔ)，引入手性環(huán)境使對(duì)映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異而進(jìn)行分離。通常分間接法和直接法，前者是對(duì)映體混合物以手性試劑作柱前衍生，形成一非對(duì)映體，然后以常規(guī)（偶也見(jiàn)手性）固定相分離。后者是直接以手性流動(dòng)相（CMP）或手性固定相（CSP）直接進(jìn)行分離。

　　1、手性衍生化試劑法

　　手性衍生化試劑（CDR）法是在分子間引入手性中心，其產(chǎn)物為非對(duì)映異構(gòu)體（diastereomer，DSTM），從而進(jìn)行分離。

　　下列情況通常選用CDR法進(jìn)行拆分：（1）不宜直接拆分。添加某些基團(tuán)，以增加色譜系統(tǒng)的選擇性。如游離胺類(lèi)在CSP上往往是頗弱的色譜性質(zhì)，生成中性化合物后則獲顯著改善。（2）提高紫外或熒光檢測(cè)的效果。劉雁鳴等用NBD-（L）-APY熒光試劑柱前衍生化測(cè)定布洛芬對(duì)映體，提高了檢測(cè)靈敏度。對(duì)CDR的要求通常為：溶質(zhì)分子至少有一個(gè)（多個(gè)時(shí)其性質(zhì)各不相同）功能團(tuán)供衍生（多為-NH2，-OH或-COOH）。光學(xué)活性試劑必需是手性高純度；反應(yīng)條件必須溫和、簡(jiǎn)便；宜附有發(fā)色或熒光基團(tuán)。

　　目前，已有許多商品化的CDR可供選用，常見(jiàn)的CDR可分為以下幾類(lèi)：（1）異硫氰酸酯和異氰酸酯類(lèi)此類(lèi)試劑易與大多數(shù)醇類(lèi)及胺類(lèi)化合物反應(yīng)進(jìn)而被分離，如麻黃素類(lèi)，腎上腺素類(lèi)，腎上腺素拮抗劑，兒茶酚胺類(lèi)等。王亞芹等采用S（ ）-1-（1-苯基）乙基異氰酸酯為衍生化試劑分析了血漿中普羅帕酮的對(duì)應(yīng)體，并研究了其在健康人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。邱宗蔭等用乙酰葡萄糖異硫氰酸酯（GITC）為柱前CDR，以反相HPLC法測(cè)定血漿中地佐西平對(duì)映體的血藥濃度，線性范圍為5～200μg.L-1。陳冰等用GITC為柱前CDR，用反相HPLC法測(cè)定血漿中普羅帕酮對(duì)映體的血藥濃度，適合用于臨床藥動(dòng)藥效學(xué)研究。（2）萘衍生物類(lèi)由于此類(lèi)化合物有利于提高立體選擇性和檢測(cè)靈敏度，因此萘的各種衍生物用作手性試劑十分普遍。Wainer等選用萘甲醛（NDH）為手性試劑，與其縮合成惡唑烷衍生物，成功地分離了麻黃堿、4-甲氧基麻黃堿、偽麻黃堿。Bhatti等用S-（ ）-1-（1-萘基）-乙基異氰酸酯為CDR，用HPLC法測(cè)定了人血漿中美托洛爾對(duì)映體濃度。（3）酰氯與磺酰氯類(lèi)此類(lèi)試劑可與化合物直接縮合，或與樣品反應(yīng)后，再引入其它基團(tuán)，合成更有利于拆分與檢測(cè)的衍生物。Sallustio等以SOCl2與芳丙酸類(lèi)消炎鎮(zhèn)痛藥如2-苯丙酸、酮洛芬及非諾洛芬的血漿樣品提取物反應(yīng)，然后再與R-2-苯乙胺成酰胺衍生物，產(chǎn)物以NP（Sil，乙腈∶二氯甲烷，5∶95）分離，異構(gòu)體均可完全拆分。（4）光學(xué)活性氨基酸類(lèi)為最早采用的色譜手性試劑，為提高反應(yīng)活性和定量回收率，常將羧基轉(zhuǎn)化成酰氯、酸酐等。此類(lèi)試劑廣泛用于胺、羧酸及醇類(lèi)藥物，尤其是氨基酸類(lèi)，其衍生化法多基于肽合成原理。

　　本類(lèi)方法要求手性藥物具有活潑反應(yīng)基團(tuán)，同時(shí)兩個(gè)對(duì)映體的衍生化速度應(yīng)相同，否則會(huì)引起非對(duì)映體與原對(duì)映體的組成產(chǎn)生差異，另外要求手性衍生化試劑光學(xué)純度高，反應(yīng)要迅速、徹底，因此應(yīng)用受到一定限制。

　　2、直接方法

　　直接方法是在分子間引入手性環(huán)境，即采用手性流動(dòng)相或手性固定相不經(jīng)柱前衍生化直接分離藥物對(duì)映體的方法，該法近年發(fā)展迅速。

　　2.1 手性流動(dòng)相拆分法向流動(dòng)相中加入一手性試劑，它與溶質(zhì)常以氫鍵、離子鍵或金屬離子的配位健生成非對(duì)映體締合物，從而以常規(guī)HPLC固定相分離。分離機(jī)理為：（1）在流動(dòng)相中形成立體選擇性復(fù)合物；（2）手性流動(dòng)相添加劑（CMPA）與固定相之間發(fā)生作用，形成動(dòng)態(tài)的CSP，該法可通過(guò)改變CMPA的種類(lèi)、濃度及流動(dòng)相的組成而優(yōu)化分離條件。

　　常用的CMPA主要有：（1）環(huán)糊精類(lèi)主要是α-、β-和γ-環(huán)糊精及其衍生物。Eto等用β-環(huán)糊精測(cè)定了數(shù)種巴比妥類(lèi)和乙內(nèi)酰脲類(lèi)藥物在生物體液中的對(duì)映體濃度。謝劍煒等用β-環(huán)糊精手性流動(dòng)相添加劑，用反相HPLC法首次抗膽堿能藥物鹽酸戊乙奎醚、鹽酸苯環(huán)壬酯和鹽酸卡馬特靈，3個(gè)手性藥物4對(duì)對(duì)映體完全達(dá)到基線分離。（2）手性離子對(duì)試劑，karlsso等以N-苯甲酰甘氨酰脯氨酸作為CMPA，分離測(cè)定了血漿中（R）-和（S）-普萘洛爾。與HPLC中的離子對(duì)法的差別主要在于前者是手性離子對(duì)試劑，由于CMPA價(jià)格昂貴，其體系穩(wěn)定性差等原因，應(yīng)用受到一定的限制。范柏等用L-苯丙氨酸為配合劑，Cu2 為配合離子，用簡(jiǎn)便的手性配合交換反相HPLC法成功拆分了氧氟沙星對(duì)映體，手性流動(dòng)相為6mmol.L-1L（D）-苯丙氨酸，3mmol.L-1硫酸銅-甲醇（83∶17）。

　　2.2 手性固定相拆分法由于CSP技術(shù)的飛速發(fā)展，采用CSP分離對(duì)映體化合物的方法應(yīng)用越來(lái)越廣泛。目前，商品化的手性柱已有數(shù)十種，卻無(wú)一具有類(lèi)似ODS柱那樣普遍的適應(yīng)性，且價(jià)格昂貴。隨著手性識(shí)別機(jī)理的深入研究，新方法、新理論不斷提出，預(yù)計(jì)將會(huì)有價(jià)廉、適應(yīng)性廣的CSP面世。（1）環(huán)糊精鍵合相α-、β-和γ-環(huán)糊精（CD）是分別由6～8個(gè)葡萄糖單位通過(guò)α-（1、4）連接構(gòu)成的環(huán)狀低聚糖，CD-CSP通過(guò)共價(jià)鍵將CD分子鍵合到硅膠上，形成對(duì)水穩(wěn)定的鍵合相。β-CD鍵合相的立體選擇性較好，應(yīng)用最多。β-CD柱上分離較好的化合物通常其手性中心為分子中環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分，或至少與兩個(gè)SP2雜化碳原子相連。Berthod等采用商品的β-CD柱（CydobondⅠ）和γ-CD柱（CydobondⅡ）拆分了25種不同類(lèi)型的手性藥物，其中對(duì)映體之間達(dá)基線分離的有11種。（2）吸附絡(luò)合物形成相要想實(shí)現(xiàn)手性識(shí)別，手性化合物與CSP之間至少應(yīng)存在三種相互作用，稱(chēng)為三點(diǎn)識(shí)別模式。這些作用可以是氫鍵、靜電作用、疏水作用、π-π作用、偶極-偶極作用或空間作用，一般通過(guò)將某些氨基酸，如（R）-或（S）-苯基甘氨酸等分子中的α-氨基與3，5-二硝基苯甲酰氯反應(yīng)后，離子或共價(jià)鍵合到氨丙基硅膠上而制得。該類(lèi)固定相通常按正相方式操作，其在藥物分析中應(yīng)用較少，后來(lái)，RUSTUM等發(fā)現(xiàn)也可使用反相分離系統(tǒng)，從而擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。（3）手性聚合物相用不同方法將纖維素衍生物涂復(fù)于大孔硅膠上而制得，在此類(lèi)固定相上得到成功分離的化合物大都含有苯基、羰基、腈基、磺�；�或羥基等。目前，纖維素—三（3.5一二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相應(yīng)用較多。例如，用三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）纖維素衍生物為CSP對(duì)血漿中普萘洛爾對(duì)映體的測(cè)定。Shibukawa等人采用3，5-二甲苯基氨基甲酸酯衍生化的直鏈淀粉手性固定相（AD-CSP）分離了維拉帕米及其代謝產(chǎn)物去甲維拉帕米的對(duì)映體，方法的線性范圍為2.5～100μg.L-1。（4）蛋白質(zhì)鍵合相以離子鍵（或共價(jià)鍵）和蛋白交聯(lián)作用將蛋白質(zhì)固定于硅膠上，利用蛋白質(zhì)分子與手性化合物分子間的立體選擇性作用，進(jìn)行藥物對(duì)映體分離，其機(jī)理一般有氫鍵、靜電作用、疏水作用、離子對(duì)和離子交換作用。將α1-酸性糖蛋白（α1-AGP）固定到硅膠上而制得AGP柱可直接分離許多堿性、酸性及中性藥物對(duì)映體。鐘大放等用CHIRAL-AGP柱，選擇不同流動(dòng)相分別拆分了SFZ-47、KMBZ-009和地丙苯酮3種藥物的4對(duì)對(duì)映體，并研究了SFZ-47在家犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。Schmidt等人以α1-酸性糖蛋白為CSP測(cè)定人體血漿中美沙酮對(duì)映體的含量。Orn等以α1-酸性糖蛋白為CSP可使α2-拮抗劑medetomidine-HCl對(duì)映體在8min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。

　　由于光學(xué)異構(gòu)體往往存在生物活性的巨大差異，因此，對(duì)映體拆分研究的最大受益者可以說(shuō)首選藥學(xué)，在研制含手性中心的新藥過(guò)程中，也應(yīng)分別評(píng)價(jià)單個(gè)對(duì)映體的效能、毒性及藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)。隨著高效，簡(jiǎn)便快速，易于自動(dòng)化的手性藥物分析技術(shù)的發(fā)展，必將把手性藥物的鑒定、研究及其質(zhì)量控制和生產(chǎn)推進(jìn)至一個(gè)嶄新的發(fā)展時(shí)期。