【摘要】目的建立訶子提取物中鞣花酸含量的高效液相色譜（HPLC）測(cè)定方法。方法色譜條件Shim-packCLC-ODS色譜柱（150mm×6mm，5μm），柱溫30℃,用CH3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4（0.05mol/L）（體積比30∶2∶68）作為流動(dòng)相,檢測(cè)波長為254nm。結(jié)果鞣花酸在0.268～5.36μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。平均加樣回收率為98.42%,RSD為1.13%（n=5）。結(jié)論該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于訶子中鞣花酸的含量測(cè)定。
　　
　　【關(guān)鍵詞】訶子;鞣花酸;高效液相色譜
　　
　　訶子TerminaliachebulaRotz.又名訶黎、訶黎勒、隨風(fēng)子，為使君子科植物的果實(shí)[1]。訶子作為中藥在中醫(yī)臨床上廣泛使用，用于油脂抗氧化方面的研究在國內(nèi)已見有專門報(bào)道[2]。訶子果實(shí)中含豐富的鞣質(zhì)和多元酚類，約為30%～40%[3]已有文獻(xiàn)報(bào)道，鞣質(zhì)和多元酚類具有較好的抗氧化性[4]。
　　
　　鞣花酸（2，3，7，8-tetrahydroxybenzopyrano[5，4，3-cde]benzopyran-5，10-dione）是一種植物多酚類化合物[5]（如圖1），為訶子中主要的活性成分之一，廣泛存在于各種自然的軟果、堅(jiān)果等植物果實(shí)中。它對(duì)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)癌變及其他多種癌變有明顯的抑制作用，它能與人體內(nèi)有害自由基結(jié)合，具有強(qiáng)力祛癌變功效，可以抗衰老、增加機(jī)體免疫，還具有降壓、鎮(zhèn)靜作用，對(duì)多種細(xì)菌、病毒有很好的抑制作用[6]。因此鞣花酸有“克癌之星”“致癌物清除劑”之美稱。從機(jī)理上講，鞣花酸是一種抗氧化劑[7]，它可作為保健食品添加劑，研究、開發(fā)本品具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的應(yīng)用范圍。
　　
　　本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定訶子中鞣花酸含量的方法，并對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的多種色譜條件進(jìn)行了比較[8～10]，表明本文方法精確可行。
　　
　　1儀器與試劑
　　
　　日本島津SPD-10AT高效液相色譜儀;SPD-10Avp檢測(cè)器;SIL-10AP自動(dòng)進(jìn)樣器;超純水器（arium611UF，Sartorius）;超聲波清洗器（AS3120A，天津瑞森特）;電子天平（AdventurerTM，AR2140，上海奧豪斯公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-200，瑞士Buchi）。島津UV2100型，甲醇為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水，蒸餾水自制，其它試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭��?br />　　
　　鞣花酸對(duì)照品（購自購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）,純度≥98%。訶子（產(chǎn)自云南臨倉和緬甸）。
　　
　　圖1鞣花酸的結(jié)構(gòu)
　　
　　2方法
　　
　　2.1色譜條件色譜柱為島津Shim-packCLC-ODS柱（150mm×6mm，5μm），柱溫30℃，用CH3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4（0.05mol/L）（體積比34∶2∶64）作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為254nm。
　　
　　2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取鞣花酸對(duì)照品6.7mg，加甲醇25ml制成每毫升含0.268mg的對(duì)照品溶液。
　　
　　2.3供試品溶液的制備精密稱取訶子粉（均過60目篩）約1g，置于100ml具塞三角燒瓶中，加60%乙醇25ml，超聲提取60min，過濾，用60%洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸干，加甲醇定容至10ml，以0.45μm微孔濾膜濾過，濾液作為樣品供試液，進(jìn)樣10μl。
　　
　　2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密吸取對(duì)照品溶液1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0μl進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，并以色譜峰峰面積（A）對(duì)對(duì)照品的量（m）回歸（包括原點(diǎn)），得回歸方程為A=7.5777E 06m 9.6700E 05（R=0.9999）。鞣花酸0.268～5.36μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。
　　
　　2.5精密度和樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)對(duì)照品溶液10μl/次，測(cè)得鞣花酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.9%（n=6）;對(duì)同一樣品按擬定的方法作多次測(cè)定，其含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.1%（n=5）。
　　
　　a-鞣花酸對(duì)照品b-訶子樣品
　　
　　圖2對(duì)照品和樣品色譜圖
　　
　　2.6回收率實(shí)驗(yàn)采用加樣回收法取已知量的訶子，分別添加一定量的鞣花酸對(duì)照品，按擬定的方法測(cè)定，結(jié)果平均回收率為98.42%,RSD為1.13%（n=5）。
　　
　　2.7樣品測(cè)定按上述“2.3”項(xiàng)樣品液制備方法測(cè)定云南產(chǎn)訶子和緬甸產(chǎn)訶子中鞣花酸的含量,云南產(chǎn)訶子和緬甸產(chǎn)訶子的鞣花酸含量分別為0.573mg/g（RSD=3.4%）和0.567mg/g（RSD=4.2%）。
　　
　　3結(jié)果
　　
　　3.1最佳檢測(cè)波長的選擇對(duì)鞣花酸對(duì)照品甲醇溶液的紫外-可見光（200～600nm）掃描發(fā)現(xiàn)，鞣花酸在254nm有最大吸收，故選擇254nm為其檢測(cè)波長。
　　
　　3.2流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若僅用甲醇和水作流動(dòng)相，很難實(shí)現(xiàn)多酚物質(zhì)的分離。通過改變流動(dòng)相的pH值來提高分離度，由于pH太低會(huì)損壞色譜柱，導(dǎo)致柱效降低。本實(shí)驗(yàn)選用磷酸和磷酸鹽緩沖體系，醋酸乙酯和甲醇作流動(dòng)相，流動(dòng)相中加入了一定量的磷酸，對(duì)鞣花酸起離子抑制作用，使其與雜質(zhì)峰達(dá)到很好地分離。
　　
　　3.3流速對(duì)分離度的影響在一定流速范圍內(nèi)，流速減少，柱效提高，分離度變大。但若流速過慢，分析時(shí)間延長，縱向擴(kuò)散的影響變大，柱效降低。雖然提高流速可縮短分析時(shí)間，但若流速過高，物質(zhì)來不及分離就被洗出，分離效果差，而且會(huì)損壞泵頭和色譜柱。因此，流速對(duì)分離度的影響也很大。最終確定流速為1.0ml·min-1時(shí)，出峰時(shí)間和分離效果均較滿意。
　　
　　4結(jié)論
　　
　　本法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。由于訶子提取物具有良好的藥用價(jià)值，對(duì)多個(gè)系統(tǒng)疾病具有良好的治療作用，具有較好的開發(fā)前景。本研究采用HPLC法測(cè)定訶子中鞣花酸含量，方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，測(cè)定結(jié)果可靠，為訶子在食品開發(fā)及醫(yī)藥應(yīng)用上提供科學(xué)依據(jù)。