摘要：建立了使用氫氧化鈉淋洗液時(shí)用計(jì)算機(jī)模擬離子色譜梯度淋洗分離陰離子的新方法，研究了在線性梯度淋洗過(guò)程中不同時(shí)間陰離子在色譜柱中的位置及所在位置的淋洗液濃度，得出陰離子在不同時(shí)間的容量因子、遷移速度，通過(guò)積分得到保留時(shí)間。再根據(jù)離子色譜峰峰形變化的規(guī)律，得到色譜峰峰形的參數(shù)。模擬色譜圖保留值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)誤差小于5%，模擬色譜圖的色譜峰峰形與實(shí)驗(yàn)所得到的色譜圖的色譜峰峰形也非常接近。
　　
　　1引言
　　
　　用離子色譜法適合于分析無(wú)機(jī)、有機(jī)陰離子。梯度淋洗是快速、靈敏分析強(qiáng)保留離子和弱保留離子混合物的有效方法。但梯度淋洗的條件的摸索卻相當(dāng)費(fèi)時(shí)，如果能創(chuàng)建計(jì)算機(jī)模擬程序，先根據(jù)樣品的組成，對(duì)要分析的樣品進(jìn)行模擬分離，得出大致條件，再通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行適當(dāng)校正，能大大提高工作效率。實(shí)現(xiàn)離子色譜線性梯度條件下分離陰離子的計(jì)算機(jī)模擬的關(guān)鍵是梯度條件下陰離子保留值的預(yù)測(cè)和離子色譜峰峰形的預(yù)測(cè)。Madden等［１］研究了用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificialneuralnetwork）對(duì)離子色譜線性梯度條件下分離陰離子的保留值的預(yù)測(cè)。該方法用一系列不同的梯度淋洗的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，從而使此系統(tǒng)有預(yù)測(cè)智能。國(guó)外一些學(xué)者在經(jīng)典離子交換色譜梯度淋洗分離蛋白質(zhì)保留值的預(yù)測(cè)方面進(jìn)行了很多工作[2～４]。國(guó)內(nèi)尚未見在梯度條件下陰離子保留值的預(yù)測(cè)和離子色譜模擬分離方面工作的報(bào)道。人們?cè)诜聪嘁合嗌�譜梯度條件下組分保留值的預(yù)測(cè)方面也做了大量的工作[５～７]。
　　
　　本實(shí)驗(yàn)使用DionexAS18陰離子分離拄，用ＮaOH淋洗液，研究了在梯度淋洗過(guò)程中不同時(shí)間組分質(zhì)點(diǎn)在離子色譜柱中的位置，及所在時(shí)間和位置的淋洗液濃度，得出所在時(shí)間和位置的容量因子，從而得出組分所在時(shí)間和位置的遷移速度，通過(guò)積分得出保留時(shí)間。再根據(jù)離子色譜峰峰形變化的規(guī)律，得到色譜峰峰形的有關(guān)參數(shù)，編程進(jìn)行模擬分離，得到了保留時(shí)間與峰形與實(shí)驗(yàn)非常接近的色譜圖。
　　
　　2理論
　　
　　2.1等度淋洗保留模型
　　
　　梯度淋洗保留值的數(shù)學(xué)模型是建立在等度淋洗的數(shù)學(xué)模型基礎(chǔ)上的。使用NaOH作為淋洗液時(shí)，常用實(shí)驗(yàn)節(jié)點(diǎn)模型（EEPM）[８]預(yù)測(cè)保留值，陰離子容量因子k和ＮaOH濃度關(guān)系如下：lgk=C1 C2lg［OH－］（1）通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以求出待定系數(shù)C1和C2。
　　
　　還有一個(gè)模型稱為DryLab模型[９]，此模型在EEPM基礎(chǔ)上加了一個(gè)二次項(xiàng)校正：lgk=C1 C2lg［ＯＨ－］＋Ｃ３（lg［ＯＨ］）２（2）Madden等[９]的研究證明，用DryLab模型對(duì)一些極弱有機(jī)酸陰離子和磷酸根等離子的誤差更小。
　　
　　由于EEPM模型預(yù)測(cè)較簡(jiǎn)單又較準(zhǔn)確，對(duì)于大多數(shù)陰離子，則采用EEPM模型預(yù)測(cè)；對(duì)于磷酸根、砷酸根等陰離子，則采用DryLab模型。
　　
　　2.2梯度淋洗的保留值的數(shù)學(xué)模型
　　
　�。玻�２．１初始等度運(yùn)行階段梯度程序開始有時(shí)有一段等度運(yùn)行時(shí)間t0，此時(shí)整個(gè)色譜柱，淋洗液的濃度均為初始濃度。如果用EEPM模型，此時(shí)組分質(zhì)點(diǎn)的遷移速度為：v=v0k0 1=v0exp（C1 C2lg［ＯＨ－］0）＋１（３）其中v為組分質(zhì)點(diǎn)的遷移速度，v0為淋洗液質(zhì)點(diǎn)的遷移速度，[OH－]0為淋洗液的初始濃度。
　　
　�。玻�２．２淋洗液的濃度開始增加到停止增加階段等度運(yùn)行時(shí)間t0過(guò)后，淋洗液濃度開始升高。對(duì)于低壓梯度色譜系統(tǒng)，淋洗液濃度的升高是從比例閥開始的，經(jīng)過(guò)壓力傳感器、泵頭、梯度混合器及管路到進(jìn)樣環(huán)、到色譜柱頭，需要一段時(shí)間，這段時(shí)間稱之為儀器滯后時(shí)間[5,6]。該滯后時(shí)間對(duì)等度淋洗不會(huì)產(chǎn)生絲毫影響，但使得梯度淋洗液的濃度變化延時(shí)。初始時(shí)間后到初始時(shí)間加儀器滯后時(shí)間范圍內(nèi)，雖然比例閥處淋洗液濃度已在升高，但整個(gè)色譜柱內(nèi)，淋洗液的濃度仍為初始濃度，此時(shí)組分質(zhì)點(diǎn)的遷移速度仍為（3）式。初始等度運(yùn)行時(shí)間加儀器滯后時(shí)間，在色譜柱柱頭，淋洗液的濃度開始上升。但由于前一段時(shí)間的等度淋洗，組分質(zhì)點(diǎn)已遷移了一段距離，在組分質(zhì)點(diǎn)處，在濃度開始增加的淋洗液質(zhì)點(diǎn)追上組分質(zhì)點(diǎn)前，淋洗液的濃度仍為初始濃度，此時(shí)組分質(zhì)點(diǎn)的遷移速度仍為（3）式。
　　
　　再經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，濃度開始增加的淋洗液質(zhì)點(diǎn)追上組分質(zhì)點(diǎn)，從此時(shí)到淋洗液濃度停止增加，組分質(zhì)點(diǎn)位置的淋洗液的濃度為：［ＯＨ－］＝［ＯＨ－］０＋（t-td-t0-t1）S（4）其中t為從進(jìn)樣到此時(shí)的時(shí)間，td為儀器滯后時(shí)間，t0為初始等度運(yùn)行時(shí)間，t1為淋洗液質(zhì)點(diǎn)從柱頭到追上組分質(zhì)點(diǎn)所需要的時(shí)間。s為單位時(shí)間淋洗液濃度的增加值。此時(shí)組分質(zhì)點(diǎn)的遷移速度為：v=v0[]k0 1=v0exp｛Ｃ１＋Ｃ２lg［［ＯＨ－］０＋（t-td-t0-t1）S］｝＋１（5）２．２．3淋洗液的濃度上升停止階段淋洗液濃度停止增加后的開始階段，濃度停止增加的淋洗液質(zhì)點(diǎn)還沒有追上組分質(zhì)點(diǎn)。在組分質(zhì)點(diǎn)位置處，淋洗液濃度還在繼續(xù)增加，組分質(zhì)點(diǎn)位置的淋洗液的濃度仍然為（4）式，此時(shí)組分質(zhì)點(diǎn)的遷移速度仍然為（5）式。
　　
　　一段時(shí)間后，濃度停止增加的淋洗液質(zhì)點(diǎn)追上組分質(zhì)點(diǎn)，則組分質(zhì)點(diǎn)位置的淋洗液的濃度為此階梯度的淋洗液最終濃度。此時(shí)組分質(zhì)點(diǎn)的遷移速度為：v=v0k １=v0C1 C2lg［ＯＨ－］f＋１（６）[OH-]f為此階梯度的淋洗液最終濃度。則一階離子色譜線性梯度條件下組分離子保留時(shí)間為：tR=l1vi＋∫l20dlv＋l３vf=l1＋l3v0/［exp（C1 C2lg［ＯＨ－］０）］＋１＋∫l20dlv0／［exp（C1 C2lg［ＯＨ－］０）］（7）其中vi為初始等度淋洗階段組分離子的遷移速度，l1為在此遷移速度下組分的遷移的距離，l2為在梯度淋洗條件下組分變速遷移的距離，vf為淋洗液的濃度為最終濃度階段組分離子的遷移速度，l3為在此遷移速度下遷移的距離。需要注意的是，這里梯度淋洗階段和最終濃度階段，是針對(duì)組分所處的位置的淋洗液的濃度而言，滯后于梯度程序的梯度淋洗階段和最終濃度階段。
　　
　　3實(shí)驗(yàn)部分
　　
　　3.1儀器和試劑
　　
　　美國(guó)Dionex2500IC離子色譜儀系統(tǒng)，配有GP50梯度泵、LC250柱溫箱、脫氣裝置、ED50電導(dǎo)檢測(cè)器、ASRSULTRAII（2mm）電導(dǎo)抑制器、戴爾P4電腦配Chromeleon色譜工作站及BorlandDelphi7.0程序設(shè)計(jì)語(yǔ)言。實(shí)驗(yàn)所用的甲酸、NaCl,NaNO3等試劑均為分析純?cè)噭��?br />　　
　　3.2色譜柱和流動(dòng)相
　　
　　以濃度為50%的NaOH溶液（美國(guó)FairLawn公司）配制淋洗液。用去離子水將分析純?cè)噭┘姿�、氯化鈉，亞硝酸鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、磷酸鈉、碘化鉀、檸檬酸三鈉配制成濃度為200mg/L的儲(chǔ)備液，使用前將其稀釋成濃度為2~10mg/L的溶液。所用水為去離子水，其電阻率大于10MΩ?cm。
　　
　　IonPacAG18陰離子保護(hù)柱（50mm×2mmi.d.），IonPacAS18陰離子分離柱（250mm×2mmi.d.）。柱溫：30℃。以NaOH溶液作為淋洗液，由去離子水和NaOH溶液組二元梯度淋洗系統(tǒng)。A為去離子水；B濃度為100mmol/L的NaOH溶液。淋洗液流速：0.25mL/min。
　　
　　3.3儀器滯后時(shí)間td和死時(shí)間tM的測(cè)定
　　
　　將離子色譜保護(hù)柱柱頭的淋洗液管路斷開，開泵用100%的去離子水的沖洗。將壓力傳感器、泵頭、梯度混合器及管路到進(jìn)樣環(huán)里面的ＮaOH沖洗干凈后（通過(guò)測(cè)流出液的pH值），開始輸送NaOH溶液，流速為0.25mL/min。從這時(shí)起到進(jìn)樣環(huán)流出液為堿性，這段時(shí)間即為儀器滯后時(shí)間td。在此色譜條件下，測(cè)得td=3.75min。以去離子水的負(fù)峰的出峰時(shí)間作為死時(shí)間，測(cè)得tM=2.95min。
　　
　　4結(jié)果與討論
　　
　　4.1不同陰離子容量因子的對(duì)數(shù)與淋洗液濃度的對(duì)數(shù)的關(guān)系
　　
　　對(duì)于所研究的每一種陰離子，通過(guò)測(cè)得的7~10個(gè)不同淋洗液濃度條件下的保留時(shí)間，算出在不同淋洗液濃度條件下的容量因子。通過(guò)一元線性回歸（用EEPM模型）或二次多項(xiàng)式回歸（用DryLab模型）處理，得到不同陰離子容量因子的對(duì)數(shù)與淋洗液濃度的對(duì)數(shù)的關(guān)系的回歸方程（見表1）。將不同陰離子的回歸方程的C1、C2和C3存入數(shù)據(jù)庫(kù)，模擬時(shí)調(diào)用。對(duì)于絕大多數(shù)陰離子，用EEPM模型就能準(zhǔn)確地描敘陰離子容量因子的對(duì)數(shù)與淋洗液濃度的對(duì)數(shù)的關(guān)系。但對(duì)于磷酸根這樣的末級(jí)電離常數(shù)非常小的陰離子，用DryLab模型較好[８]。
　　
　　4.2計(jì)算機(jī)模擬程序
　　
　　設(shè)計(jì)一Delphi程序，模擬用NaOH淋洗液梯度淋洗分離不同的陰離子。程序運(yùn)行后，選擇梯度淋洗的色譜條件，選擇模擬分離的陰離子及濃度。模擬進(jìn)樣后，程序根據(jù)選擇的數(shù)據(jù)，從數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)出不同的陰離子的容量因子隨淋洗液濃度變化關(guān)系數(shù)據(jù)，運(yùn)用前面所述的數(shù)學(xué)模型，算出各時(shí)刻陰離子質(zhì)點(diǎn)所在位置的淋洗液濃度、對(duì)應(yīng)的容量因子、遷移速度、保留時(shí)間。色譜圖用修改的高斯曲線模型EMG曲線模型[９，１０]模擬。通過(guò)實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)處理后得到不同的陰離子在等度淋洗及梯度淋洗條件下的EMG參數(shù)隨保留值變化的速率，存入數(shù)據(jù)庫(kù)，模擬時(shí)調(diào)用。梯度淋洗時(shí)EMG參數(shù)σ、τ隨保留值增加的速率較慢，從而模擬得到較窄的色譜峰�；�線漂移的模擬是根據(jù)實(shí)際每分鐘漂移的信號(hào)的大小，將漂移值疊加到修改的高斯曲線中�；�線的噪音通過(guò)將隨機(jī)函數(shù)值疊加到修改的高斯曲線進(jìn)行模擬。
　　
　　表18種陰離子容量因子的對(duì)數(shù)與淋洗液濃度的對(duì)數(shù)的關(guān)系的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（略）
　　
　　Table1Regressionequationsandcorrelationcoefficientsof8anionsoflgarithmsofretentionfactorsandlgarithmsofconcentrationsofsodiumhydroxide
　　
　　4.3模擬結(jié)果及討論
　　
　　圖1A和圖1B分別為２種不同的梯度程序淋洗甲酸根、Cl、ＮＯ－２、ＳＯ２－４、ＮＯ－３、ＰＯ３－４、檸檬酸根和Ｉ－的色譜圖和模擬色譜圖。表2為這些陰離子在這２種梯度淋洗條件下保留值的預(yù)測(cè)值誤差的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。梯度淋洗程序1為比較平緩的線性梯度，條件為：開始時(shí)淋洗液濃度從32mmol/L線性上升，15min后升高到80mmol/L，保持5min后回到初始濃度。梯度淋洗程序2為比較陡峭的線性梯度，條件為：開始有4min的淋洗液濃度為28mmol/L的等度淋洗，4min后淋洗液濃度開始線性上升，上升1min后升高到100mmol/L，保持15min后回到初始濃度，此梯度接近于一臺(tái)階梯度。
　　
　　圖1中甲酸根、Ｃl-和NO-2實(shí)際是等度淋洗出色譜柱的。因?yàn)閮x器在此條件下有3.75min的滯后時(shí)間，濃度升高的淋洗液還沒有到達(dá)色譜柱頭，甲酸根已流出色譜柱。雖然Ｃl-和NO-2的保留時(shí)間大于儀器的滯后時(shí)間，但濃度升高的淋洗液到達(dá)色譜柱頭時(shí)，Ｃl-和NO-2已快流出色譜柱，濃度升高的淋洗液還未追上Cl-，Cl-和NO-2已流出色譜柱。同理，由于有4min的等度淋洗，圖1B中除了甲酸根、Cl-、NO-2外，SO2-4也是等度淋洗出色譜柱的。
　　
　　圖18種陰離子的色譜圖（a）和模擬色譜圖（b）（略）
　　
　　Fig.1Chromatogram（a）andsimulatingchromatogram（b）of8anions
　　
　　A.程序1――平緩線性梯度（gradientelutionprofile1:mildlineargradient）;B.程序2――陡峭線性梯度（gradientelutionprofile2:steeplineargradient）。1.HCOO-;2.Cl-;3.NO-2;4.SO2-4;5.NO-3;6.PO3-4;7.檸檬酸根（citrate）;8.I-。
　　
　　從表2可以看出，此程序模擬離子色譜梯度淋洗陰離子，無(wú)論是比較平緩的線性梯度還是接近于臺(tái)階梯度的線性梯度，模擬色譜圖的保留時(shí)間是比較準(zhǔn)確的，最大相對(duì)誤差小于5%。
　　
　　表2梯度淋洗條件下8種陰離子實(shí)驗(yàn)色譜圖的保留時(shí)間與模擬色譜圖保留時(shí)間的比較（略）
　　　　
　　離子色譜梯度淋洗陰離子色譜峰峰形的變化規(guī)律比較復(fù)雜。對(duì)于比較平緩的線性梯度（如圖1A）。變化規(guī)律比較簡(jiǎn)單，基本上符合色譜峰的EMG參數(shù)σ（標(biāo)準(zhǔn)偏差）、τ（指數(shù)衰減時(shí)間常數(shù)）隨保留時(shí)間線性變化的規(guī)律[11]，圖1A（b）就是基于這種數(shù)學(xué)模型模擬的結(jié)果。與圖1A（a）進(jìn)行比較，色譜峰峰形非常接近。對(duì)于臺(tái)階梯度和比較陡的線性梯度，色譜峰峰形的變化規(guī)律相當(dāng)復(fù)雜，臺(tái)階梯度和比較陡的線性梯度的色譜圖一般有一個(gè)陡坡，一般來(lái)說(shuō)，在靠近陡坡頂出峰的色譜峰，色譜峰比較窄。在有些情況下，色譜峰特別窄（如圖1B），保留時(shí)間較長(zhǎng)的檸檬酸根的色譜峰還大大窄于保留時(shí)間較短的ＳＯ２４、ＮＯ－２的色譜峰。用此峰來(lái)計(jì)算色譜柱柱效，柱效離奇的高（色譜工作站顯示用檸檬酸根的色譜峰計(jì)算色譜柱柱效高達(dá)36401理論塔板數(shù)，其半蜂寬大大低于保留時(shí)間較短的ＳＯ２－４、ＮＯ－２、ＰＯ３－４的保留時(shí)間）。有關(guān)機(jī)理非常復(fù)雜，Enlund等［１２］對(duì)色譜和毛細(xì)管電泳出現(xiàn)的柱效奇高的現(xiàn)象進(jìn)行了探討。本研究模擬時(shí)，也考慮了這一點(diǎn)。圖1B（b）為在圖1B（a）條件下的模擬色譜圖，模擬色譜圖與真實(shí)色譜圖的峰形非常接近。