【摘要】采用紫外�部梢娢�收光譜和熒光光譜研究了酶解小麥蛋白產(chǎn)物與還原糖不同加熱條件下的美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物。美拉德反應(yīng)在紫外區(qū)240和294nm產(chǎn)生兩個特征峰，熒光的最大激發(fā)和發(fā)射波長為347和450nm;隨反應(yīng)進行，紫外光吸收和熒光強度迅速增加，表明美拉德反應(yīng)進入高級階段，產(chǎn)生的糠醛類、呋喃酮類、吡喃酮類、噻吩類及噻唑類等小分子物質(zhì)表現(xiàn)較大的積累速率。溫度升高，強度增加速率增大。在較高溫度時，紫外光吸收出現(xiàn)最大平穩(wěn)值;熒光強度則到達最大值后降低，表明小分子物質(zhì)間或與肽聚合生成大分子黑素類物質(zhì)，小分子物質(zhì)的積累表現(xiàn)消除速率，反應(yīng)進入終級階段。
　　
　　【關(guān)鍵詞】水解植物蛋白，美拉德反應(yīng)，Strecker降解，紫外�部梢娢�收光譜，熒光光譜
　　
　　1引言
　　
　　水解植物蛋白是指用酶、酸或堿水解大豆、小麥、玉米等植物蛋白得到的混合產(chǎn)物[1]。水解植物蛋白由于其價格低廉、質(zhì)構(gòu)功能性優(yōu)良和較高的營養(yǎng)價值而被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。主要將其作為原料制備美拉德反應(yīng)型香精料[1～3]或作為添加成分提升食品的感官和營養(yǎng)品質(zhì)[4,5]。水解植物蛋白的這類應(yīng)用是通過美拉德反應(yīng)實現(xiàn)的。
　　
　　利用水解植物蛋白制備香味的美拉德反應(yīng)，主要是反應(yīng)高級階段糖降解和Strecker降解產(chǎn)生糠醛類、呋喃酮類、吡喃酮類、吡啶類、吡嗪類、噻吩類及噻唑類等揮發(fā)或半揮發(fā)性小分子氣味物質(zhì)[6];反應(yīng)過程復(fù)雜，難于應(yīng)用反應(yīng)動力學(xué)對其進行設(shè)計和監(jiān)控;反應(yīng)產(chǎn)物種類繁多，已有的檢測方法繁瑣耗時[7]。因此，研究一種簡單、快速、有效的美拉德反應(yīng)程度監(jiān)控方法，對于優(yōu)化反應(yīng)條件和控制生產(chǎn)是十分必要的。本研究以酶解小麥蛋白產(chǎn)物（wheatproteinenzymatichydrolysates，eWPH）為原料，設(shè)計了產(chǎn)生肉香味的美拉德反應(yīng)，對不同溫度�矔r間組合下的美拉德反應(yīng)進行了光譜學(xué)研究，以紫外�部梢娢�光譜和熒光分析為指標，對反應(yīng)程度和產(chǎn)物進行了表征和剖析。
　　
　　2實驗部分
　　
　　2.1儀器、材料與試劑
　　
　　UV��2102PC紫外�部梢姺止夤舛扔嫞ㄉ虾Ｓ饶峥鹿�司）;F��2500熒光分光光度計（日本Hitachi公司）;Biofuge臺式冷凍高速離心機（德國Heraeus公司）;螺口密封玻璃管（16mm×160mm，德國Schott公司）;DKU��3恒溫油槽（上海精宏公司）。小麥蛋白,蛋白質(zhì)含量>70%（青島中際華興國際貿(mào)易有限公司提供）。L�舶腚装彼�、木糖和葡萄糖（生化試劑，含量>98.5%）;堿性蛋白酶、Flavourzyme風(fēng)味酶和α�驳矸勖笧樯�化試劑。其它試劑均為分析純。
　　
　　2.2實驗方法
　　
　　2.2.1酶解小麥蛋白產(chǎn)物的制備取40g小麥蛋白配制10%（w/V）的懸浮液，調(diào)節(jié)pH至7.0，預(yù)熱至50℃，加入堿性蛋白酶、Flavourzyme風(fēng)味酶和α�驳矸勖福�酶與蛋白比例為0.5%，恒溫攪拌，水解8h。水解結(jié)束后，升溫至100℃，保持5min，滅酶活。冷卻至室溫，以4000r/min離心15min，上清液即為酶解產(chǎn)物。作3個水解平行樣品，合并上清液并定容至1200mL。
　　
　　2.2.2酶解小麥蛋白產(chǎn)物分析采用凱氏定氮法測定蛋白含量;3，5�捕�硝基水楊酸比色法[8]測定還原糖含量;甲醛滴定法[9]測定水解度;高效液相色譜法[1]測定產(chǎn)物分子量分布。
　　
　　2.2.3酶解小麥蛋白產(chǎn)物制備肉香味的美拉德反應(yīng)設(shè)計文獻[2]報道eWPH與還原糖和含硫化合物制備肉香味的美拉德反應(yīng)參數(shù)主要是pH、溫度、時間、還原糖和含硫物質(zhì)種類和用量。本研究在文獻[7,10]的基礎(chǔ)上確定將5g木糖/葡萄糖和1.35gL�舶腚装彼崛芙庥�40mL小麥蛋白水解液中，用0.1mol/LHCl或0.5mol/LNaOH調(diào)節(jié)混合液pH5.5。樣品在預(yù)定溫度下加熱一定時間后，取出，冰浴冷卻。-40℃凍存12h，室溫自然融解，12000r/min離心60min，除去反應(yīng)產(chǎn)生的褐色不溶物質(zhì)，上清液用于光譜分析�？瞻走M行同樣處理。
　　
　　2.2.4美拉德反應(yīng)紫外�部梢娢�收光譜的測定取所有樣品上清液稀釋100倍。以空白樣品為基線，用1cm石英比色皿于198～450nm波長范圍內(nèi)測定不同條件下美拉德反應(yīng)的紫外�部梢娢�收光譜。記錄特征吸收峰的波長和強度。
　　
　　2.2.5美拉德反應(yīng)熒光分析取紫外�部梢娢�收光譜的測試樣液，參照文獻[11]的方法，掃描確定eWPH與還原糖反應(yīng)體系的最大激發(fā)（λex）和發(fā)射波長（λem），測定樣品在此波長下的熒光強度。
　　
　　3結(jié)果與討論
　　
　　3.1酶解小麥蛋白產(chǎn)物分析
　　
　　采用2.2.2的方法，分析得到酶解小麥蛋白產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量為75.5g/L;還原糖含量為0.91%;水解度為21.8%。分子量分布情況為：<1000Da（34.94%）;1000～5000Da（46.64%）;>5000Da（18.42%）。
　　
　　復(fù)合酶水解法水解度高，產(chǎn)物澄清透明、低苦味，廣泛用于蛋白質(zhì)的水解中。本實驗發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶和風(fēng)味酶復(fù)合對小麥蛋白的水解效果較好。小麥蛋白原料中除了蛋白質(zhì)外，主要是淀粉，所以水解時添加了淀粉酶。酶解產(chǎn)物溶液中還原糖含量為0.91%，與蛋白質(zhì)的比例約為1∶8。
　　
　　3.2紫外�部梢娢�收光譜的分析和反應(yīng)產(chǎn)物剖析
　　
　　美拉德反應(yīng)通�？煞譃閹讉�階段[11]。初始階段起始于羰基和氨基的縮合，生成Amadori/Heyns化合物;高級階段主要是Amadori/Heyns化合物降解，釋放氨基化合物，糖類物質(zhì)通過烯醇化生成高反應(yīng)活性的鄰?fù)�糖類（Oosones）[12]、糠醛類等物質(zhì);高反應(yīng)活性的鄰?fù)�糖物質(zhì)極易裂解生成酮類物質(zhì)，酮類物質(zhì)可進行醇醛縮合，或重新與氨基化合物反應(yīng)，生成復(fù)雜的具有特征性風(fēng)味的小分子物質(zhì);終級階段主要是高級階段產(chǎn)生的小分子物質(zhì)自身或相互間聚合生成大分子褐色物質(zhì)，使體系表現(xiàn)出顯著的顏色特征。對于產(chǎn)生香味的美拉德反應(yīng)，高級階段的糖裂解和Strecker降解是至關(guān)重要的反應(yīng)步驟。該過程產(chǎn)生的小分子物質(zhì)是賦予特征風(fēng)味的成分。vanBoekel等[6]構(gòu)建了產(chǎn)生肉香味美拉德反應(yīng)框架。實際上，美拉德反應(yīng)是連續(xù)的瀑布式反應(yīng)過程，生成的風(fēng)味小分子物質(zhì)可作為反應(yīng)物進入終級階段，使小分子物質(zhì)的產(chǎn)生速率和積累量隨熱處理程度而變化。
　　
　　研究確定小分子物質(zhì)具有最大產(chǎn)生速率和產(chǎn)量的反應(yīng)條件是有意義的。但是，美拉德小分子產(chǎn)物種類極其復(fù)雜，定量分析困難。文獻[12]報道，美拉德反應(yīng)的小分子產(chǎn)物具有強紫外光吸收和熒光，所以應(yīng)用分光光度法表征小分子物質(zhì)的產(chǎn)生速率和產(chǎn)量是一種簡便、快速且低成本的新選擇。美拉德反應(yīng)主要影響因素是介質(zhì)pH、加熱溫度、時間、還原糖和含硫物質(zhì)種類和用量等。溫度�矔r間組合是最重要的參數(shù)，也是生產(chǎn)過程中的易調(diào)節(jié)因素。本實驗采用分光光度法分析不同溫度�矔r間組合下eHWP與還原糖的美拉德反應(yīng)程度和小分子產(chǎn)物情況。樣品在預(yù)定溫度（120，140和160℃）下加熱一定時間（10，20，30和60min）。所有添加木糖的樣品稱為R�蚕盗�，添加葡萄糖為G�蚕盗�，添加無糖和L�舶腚装彼岬膶φ諛悠贩Q為C�蚕盗��？瞻诪�3個系列的無加熱樣品。eHWP�策�原糖熱處理后的紫外�部梢娢�收光譜如圖1所示，混合物加熱后即在紫外區(qū)240和294nm產(chǎn)生兩個特征吸收峰。
　　
　　圖2為3個溫度下兩個吸收峰強度隨加熱時間的變化曲線。與G�埠蚏�蚕盗邢啾龋珻�蚕盗械墓馕�收強度很小，表明這兩個吸收峰主要是美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的。294nm光吸收是由糖裂解產(chǎn)生的酮、醛類等無色小分子物質(zhì)產(chǎn)生的[14～16]。240nm吸收峰鮮有報道，一般認為具有共軛雙鍵的物質(zhì)在此波長下有特征光吸收。本研究體系中，240nm吸收峰可能是由于半胱氨酸受熱脫硫生成氨基丙烯酸或Amadori化合物降解生成具有共軛雙鍵的鄰?fù)�糖類[13]而產(chǎn)生的。美拉德反應(yīng)高級階段小分子產(chǎn)物具有強紫外吸收的特征已經(jīng)被證明和應(yīng)用，但物質(zhì)種類復(fù)雜，目前尚未對其進行確認。
　　
　　隨著溫度升高或加熱時間延長，兩個特征峰強度增加，表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的具有紫外吸收的呋喃酮類、吡喃酮類、吡咯類、噻吩類、吡啶類及吡嗪類等的小分子物質(zhì)的積累。這些小分子物質(zhì)是對肉香味有貢獻的成分[7]。但是在較高溫度時，兩個峰強度出現(xiàn)最大穩(wěn)定值，表明已生成的無色小分子物質(zhì)之間或與肽等發(fā)生聚合反應(yīng)，進入到終級階段，生成褐色的大分子黑素類物質(zhì)，從而使小分子的積累表現(xiàn)出一定的消除速率。當消除速率與生成速率平衡時，在紫外光吸收圖譜上即表現(xiàn)為峰強度遲滯不變，甚至有所下降。對于產(chǎn)生香味的美拉德反應(yīng)，這種使香味小分子消除的聚合反應(yīng)是不期望的。
　　
　　3.3熒光分析對小分子產(chǎn)物的表征
　　
　　研究表明，美拉德體系中熒光強度與紫外光吸收強度的發(fā)展表現(xiàn)為不同的動力學(xué)行為[14～16]，所以熒光小分子物質(zhì)被認為是不同于具有紫外光吸收物質(zhì)的小分子產(chǎn)物。
　　
　　eHWP與還原糖熱處理后的熒光分析表明，本反應(yīng)體系347nm激發(fā)的450nm的熒光光譜與其它美拉德反應(yīng)體系[14，15]的結(jié)果相似。但不同于蛋白質(zhì)因含有色氨酸殘基而具有的熒光（λex=290nm，λem=336nm）[17]，所以體系的熒光是由美拉德反應(yīng)引起的，熒光強度表征了高級階段熒光小分子物質(zhì)的產(chǎn)生狀態(tài)。圖3為不同溫度�矔r間組合下eHWP與還原糖混合物的熒光強度。C�蚕盗�、G1和R1在60min的加熱時間內(nèi)熒光強度持續(xù)增加;G2，G3，R2和R3的熒光在加熱一定時間時達到最大值，然后降低。表明美拉德反應(yīng)進入終級階段，小分子物質(zhì)相互間或與肽等聚合成大分子褐色黑素類物質(zhì)，使小分子物質(zhì)的積累速率降低;熒光強度隨時間延長而下降則是小分子物質(zhì)的聚合消除速率大于生成速率，是產(chǎn)香美拉德反應(yīng)所不期望的。
　　
　　結(jié)合圖2和圖3，紫外�部梢姽庾V和熒光分析對美拉德反應(yīng)程度的表征結(jié)果是一致的。120℃加熱60min，140℃加熱20min以及160℃加熱10min期間，香味小分子物質(zhì)具有較大的積累速率，是產(chǎn)生香味的美拉德反應(yīng)較優(yōu)的溫度�矔r間組合。