【摘要】目的建立蓽茇止痛酊中胡椒堿的含量測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法,C18色譜柱,四氫呋喃-甲醇-水（V∶V∶V＝30∶30∶50）為流動(dòng)相,流速為1.0mL/min,柱溫為室溫,檢測(cè)波長(zhǎng)為343nm,進(jìn)樣10μL,以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果胡椒堿在8.3～41.5mg/L內(nèi)峰面積與對(duì)照品質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系,其回歸方程為：A＝3413186ρ－
　　
　　7467.7,r＝0.9998；其平均回收率為99.7%,RSD＝1.8%（n＝6）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便,重復(fù)性好,空白無干擾,可有效地控制蓽茇止痛酊制劑的質(zhì)量。
　　
　　【關(guān)鍵詞】蓽茇止痛酊；胡椒堿；高效液相色譜法
　　
　　Abstract：ObjectiveToestablishthemethodofcontentdeterminationofPiperineinBibaZhitongTincture.MethodsHPLCwasadoptedindeterminingthecontentofpiperineinBibaZhitongTincture.C18chromatographiccolumnwasusedwiththecolumntemperaturebeingtheroomtemperature.Themobilephasewastetrahydrofuran-methanol-water（V∶V∶V＝30∶30∶50）withthevelocityof1.0mL/min.Thedetectionwavelengthwas343nm,andthesamplingvolumewas10μL.Externalstandardmethodwaschosenforcontentcalculation.ResultsTheinnerpeakareaofpiperine（8.3～41.5mg/L）showedfinelinearrelationwithmassconcentrationofcontrolgroup.ItsregressionequationwasA＝3413186ρ－7467.7,r＝0.9998,withtheaveragerecoveryrationbeing99.7%,andRSD＝1.8%（n＝6）.ConclusionThemethodissimple,convenient,goodreproducibilityandnon-interference,andcaneffectivelycontrolthequalityofthepreparation.
　　
　　Keywords：BibaZhitongTincture；Piperine；HPLC
　　
　　蓽茇止痛酊由蓽茇、細(xì)辛和花椒等6味中藥組成,具有祛風(fēng)散寒止痛的功效,臨床用于治療風(fēng)寒牙痛。本制劑生產(chǎn)采用提取揮發(fā)油,水煮醇沉等工藝加工制成。蓽茇為方中君藥,其主要有效成分為胡椒堿,2005版《中華人民共和國藥典》（一部）采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定蓽茇中胡椒堿的含量[1],文獻(xiàn)報(bào)道胡椒堿的含量測(cè)定方法有高效液相色譜法[2-4]。本試驗(yàn)采用改進(jìn)四氫呋喃-甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相,外標(biāo)法測(cè)定胡椒堿的含量,較適用于本中藥復(fù)方制劑復(fù)雜成分的分離,有效控制蓽茇止痛酊的質(zhì)量。
　　
　　1儀器與試藥
　　
　　高效液相色譜儀（日本島津）LC-6A,包括：SPD-6AV檢測(cè)器,C-R4A數(shù)據(jù)處理機(jī)。胡椒堿（批號(hào)0775-9702,由中國藥品生物制品檢定所提供,純度為98.79%）；蓽茇止痛酊（批號(hào)041212、041216、041220,無錫山禾藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）。甲醇、乙腈為色譜醇,無水乙醇為分析醇,水為熏蒸水。
　　
　　2方法與結(jié)果
　　
　　2.1色譜條件
　　
　　色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm,10μm）,大連依科特科學(xué)儀器有限公司；流動(dòng)相：四氫呋喃-甲醇-水（V∶V∶V＝30∶30∶50）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：343nm；柱溫：室溫；分離度：R>1.5；理論板數(shù)按胡椒堿峰計(jì)算應(yīng)大于1500。
　　
　　2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
　　
　　對(duì)胡椒堿的乙醇溶液進(jìn)行紫外區(qū)掃描,結(jié)果胡椒堿在343nm處有最大吸收,故選用343nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
　　
　　2.3流動(dòng)相的選擇
　　
　　曾試驗(yàn)4種流動(dòng)相：①甲醇-水（77∶23）；②乙腈-水（70∶30）；③乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液（70∶30）,用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.5、3.1；④四氫呋喃-甲醇-水（30∶30∶50）,其中④使胡椒堿峰與雜質(zhì)峰分離效果好,能基線分離。
　　
　　2.4溶液的制備
　　
　　對(duì)照品溶液的制備：精密稱取胡椒堿對(duì)照品10mg,置50mL棕色量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻。精密量取5mL,置50mL棕色量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得（每1mL中含胡椒堿20μg）。
　　
　　供試品溶液的制備：精密量取蓽茇止痛酊1mL,置25mL棕色量瓶中,加無水乙醇稀釋至刻度,搖勻,于冰箱中冷藏1.5h,取出,放置至室溫,濾過,取續(xù)濾液5mL,置25mL棕色量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得。
　　
　　陰性對(duì)照液的制備：按處方中藥味的比例自配不含蓽茇的群藥,按其工藝制成陰性制劑,再按供試品溶液制備方法制成空白溶液,即得。
　　
　　2.5陰性液干擾試驗(yàn)
　　
　　精密吸取供試品溶液、陰性液和對(duì)照品溶液各10μL注入色譜儀中,由色譜圖可知,在與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相應(yīng)的位置上,供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰出現(xiàn)；而陰性液在此峰位無吸收,對(duì)本品中胡椒堿的含量測(cè)定無干擾,色譜圖見圖1。
　　
　　2.6線性關(guān)系的考察
　　
　　精密吸取胡椒堿對(duì)照品（10.38mg→50mL）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分別置25mL棕色量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻,分別精密吸取10μL,注入高效液相色譜儀,記錄峰面積。以對(duì)照品的含量對(duì)峰面積值作圖,得到一個(gè)通過原點(diǎn)的直線,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,胡椒堿在8.3～41.5mg/L范圍內(nèi)峰面積與對(duì)照品質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系,其回歸方程為：A＝3413186ρ－7467.7,r＝0.9998。
　　
　　2.7精密度試驗(yàn)
　　
　　精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)041212）,重復(fù)進(jìn)樣5次,求得RSD＝0.93%。
　　
　　2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)
　　
　　精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)041212）,分別于配制后0、2、4、8、16、24h測(cè)定色譜峰面積,計(jì)算RSD為1.2%,結(jié)果表明,其在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。
　　
　　2.9回收率試驗(yàn)
　　
　　精密吸取已知含量的同一批號(hào)（批號(hào)041212）樣品0.5mL,分別精密加入胡椒堿對(duì)照品乙醇溶液,依法測(cè)定,結(jié)果平均回收率為99.97%,RSD＝1.8%（n＝6）。見表1。表1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（略）
　　
　　2.10樣品中胡椒堿含量測(cè)定
　　
　　取3批蓽茇止痛酊樣品,照“2.4”項(xiàng)測(cè)定,結(jié)果見表2。表2樣品含量測(cè)定結(jié)果（略）
　　
　　3討論
　　
　　本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法2種方法進(jìn)行蓽茇藥材中胡椒堿含量的對(duì)比試驗(yàn),結(jié)果顯示,2種方法測(cè)定結(jié)果基本相同。2005年版《中華人民共和國藥典》采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量,結(jié)果準(zhǔn)確,但鑒于中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜,采用內(nèi)標(biāo)法時(shí)分離度難以滿足要求,因此,本實(shí)驗(yàn)研究采用外標(biāo)法更為實(shí)際、可行。
　　
　　由于蓽茇止痛酊所含成分復(fù)雜,給含量測(cè)定帶來一定的困難。我們?cè)跇悠非疤幚聿捎脽o水乙醇稀釋、冰箱中靜置除去雜質(zhì)的方法,使樣品得到凈化,可滿足含量測(cè)定的要求,且重現(xiàn)性好。