影響免疫組化染色結(jié)果的因素有很多，除了免疫組化染色操作因素外，還包括組織切片制備各個(gè)環(huán)節(jié)的因素。因此，免疫組化技術(shù)的操作規(guī)范也要包括組織切片技術(shù)的規(guī)范。
一、免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)組織切片的要求
免疫組織化學(xué)技術(shù)適用于冰凍切片和石蠟切片，部分抗體只能用于冰凍切片，大部分抗體可用于石蠟切片，適用于石蠟切片的抗體也適用于冰凍切片。冰凍切片能很好地保存
組織抗原，抗原丟失少，但形態(tài)結(jié)構(gòu)差，定位不很清晰；石蠟切片組織形態(tài)結(jié)構(gòu)好，定位清晰，但在組織的固定、脫水、包埋等過程中容易破壞組織抗原，使抗原的免疫活性有所
降低。因此在檢測(cè)石蠟切片組織抗原時(shí)，盡可能保存組織抗原的免疫活性十分重要。
二、組織的固定
組織離體以后應(yīng)及時(shí)取材固定，組織經(jīng)過固定后可保存組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織抗原彌散。常用的固定液為10％ 福爾馬林液（4%甲醛液），最好選用10％中性福爾馬林液
，固定時(shí)間為4-6小時(shí)，一般不超過24小時(shí)。固定時(shí)間不足，組織結(jié)構(gòu)不佳，組織抗原彌散；固定時(shí)間過長(zhǎng)，可封閉或破壞組織抗原。
冰凍切片常用的固定液為無水丙酮或4%多聚甲醛，固定時(shí)間為10-20min。
三、載玻片的處理
組織切片貼在載玻片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，由于染色過程操作步驟及沖洗次數(shù)較多，容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，因此將載玻片涂膠或硅化是必要的。較常用效果較好的是硅化玻
片。
硅化玻片的制備：
1. 載玻片經(jīng)酸洗，沖洗干凈后烤干。
2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。
3. 無水丙酮液浸1-2min。
3. 蒸餾水浸洗1-2min。
4. 烤干備用。
可用無水酒精代替無水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。
�。� APES（3-AMINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE） 氨丙基三乙氧基硅烷 SIGMA產(chǎn)品。
四、組織切片前處理
經(jīng)福爾馬林溶液固定，石蠟包埋的組織在固定過程中，組織中的抗原蛋白與甲醛產(chǎn)生交聯(lián)，使得組織中抗原的決定簇被封閉，抗體難以和抗原充分結(jié)合。因此要進(jìn)行組織切片
前處理，目的是打開組織抗原蛋白與甲醛的交聯(lián)，暴露組織抗原，以提高組織抗原的檢出率。組織切片前處理（也稱抗原修復(fù)）常用的方法主要有：
1. 胰蛋白酶消化法
將切片置入胰蛋白酶消化液（0.1％胰蛋白酶 0.1％氯化鈣水溶液 pH7.8）消化30分鐘，37℃。
2. 水煮法
將切片置入蒸餾水內(nèi)，加熱至沸騰持續(xù)10分鐘，自然冷卻。
3.微波加熱法
常規(guī)是將切片置入0.01mol/L pH6.0的檸檬酸緩沖液內(nèi)，用微波爐最大功率（約800W）加熱10分鐘，自然冷卻。
4. 高壓加熱法
用高壓鍋加熱0.01mol/L pH6.0的檸檬酸緩沖液至沸騰，放入切片，蓋緊高壓鍋蓋，繼續(xù)加熱至減壓閥噴氣，計(jì)時(shí)90秒鐘至2分鐘，自然冷卻。
5.聯(lián)合處理法
按上述方法先進(jìn)行胰蛋白酶消化，然后再進(jìn)行水煮法或微波加熱法或高壓加熱法。
是否進(jìn)行切片前處理要按第一抗體說明書的要求，切片前處理通�？梢蕴岣呙庖呓M化染色的陽(yáng)性率，但并非所有的抗體染色均需要前處理。切片前處理不當(dāng)會(huì)出現(xiàn)： 假陽(yáng)性、假陰
性或陽(yáng)性定位改變
五、內(nèi)源性過氧化物酶的消除
組織中的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及紅血球等存在內(nèi)源性過氧化物酶，可與顯色劑DAB、AEC起反應(yīng)而造成假陽(yáng)性，因此，在顯色前要把這些內(nèi)源性過氧化物酶消除，方法是用3％過氧
化氫作用15分鐘。操作可以在加一抗之前也可以在加一抗之后。
六、內(nèi)源性生物素的消除
組織細(xì)胞中存在著內(nèi)源性生物素，在應(yīng)用與卵白素結(jié)合或生物素標(biāo)記抗體的免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)組織細(xì)胞中的抗原時(shí)，內(nèi)源性生物素容易與ABC法中的卵白素（avidin）或S
-P（LSAB）法中的鏈霉菌抗生物素蛋白（streptavidin）結(jié)合，引起假陽(yáng)性。因此在加一抗 之前或在加一抗之后需要消除內(nèi)源性生物素。消除內(nèi)源性生物素的方法有：（1）用雞蛋
清或卵白素封閉。（2）采用不含卵白素或生物素的免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)如Envision/Elivision二步法和EPOS一步法等。
七、高敏感免疫組化染色方法的選用
免疫組織化學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)之一是敏感性高，就是能把抗原抗體結(jié)合物特異性地放大。目前，免疫組化染色方法有一步法，二步法和三步法。一般來說，抗體與抗體的連接步驟
少，特異性高，敏感性低；反之，連接步驟多，特異性低，敏感性高。但是，不同公司生產(chǎn)的試劑盒，技術(shù)由于不斷地改進(jìn)和提高，在特異性和敏感性方面各有特點(diǎn)。各實(shí)驗(yàn)室可
以根據(jù)自己的實(shí)際情況對(duì)照比較，合理選用。目前應(yīng)用最廣泛的是S-P（LSAB）三步法和Envision/Elivision二步法。同一種染色方法，因檢測(cè)試劑盒的不同其敏感性不同，第一抗
體的稀釋度也不同。
八、第一抗體與免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)的正確配套
常用的第一抗體一般為單克�。ㄊ罂梗┖投嗫寺。ㄍ每梗┛贵w，也有羊抗的抗體。常用檢測(cè)試劑盒中的第二抗體也有分為抗鼠、抗兔或抗羊免疫球蛋白，不能錯(cuò)配，否則一抗
、二抗連接不上而導(dǎo)致假陰性的染色結(jié)果。最好選用既含抗鼠又含抗兔和抗羊免疫球蛋白的抗體。
九、酶標(biāo)抗體系統(tǒng)中的酶與顯色劑的合理選用
在S-P等常用免疫組化方法中，標(biāo)記抗體的酶主要有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP或AKP），顯色劑有DAB、AEC、固紅和固藍(lán)等。在HRP系統(tǒng)用DAB和AEC作顯色劑，DAB顯
色陽(yáng)性物呈棕色，AEC呈紅色；AP系統(tǒng)用固紅、固藍(lán)或BCIP/NBT作顯色劑，固紅顯色陽(yáng)性物呈紅色，而固藍(lán)、BCIP/NBT呈藍(lán)色。DAB顯色形成的沉淀物最穩(wěn)定和不易褪色，較為常用
，因其是致癌物，故要避免接觸皮膚和污染環(huán)境。
在多重免疫組化染色中，合理選用酶標(biāo)抗體檢測(cè)系統(tǒng)和顯色劑，在同一切片上可以清晰地顯示組織細(xì)胞中多種抗原的表達(dá)。
十、實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)置
為證實(shí)抗體和檢測(cè)試劑盒效價(jià)是否可靠，染色操作是否正確，一般需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)照，以避免試劑失效或操作失當(dāng)而出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性，確保染色結(jié)果的可靠性。
1.陽(yáng)性對(duì)照：選用已知染色中度陽(yáng)性以上的組織切片染色，陽(yáng)性切片應(yīng)呈陽(yáng)性 ，此外組織中的內(nèi)對(duì)照也是很好的陽(yáng)性對(duì)照。初學(xué)者更應(yīng)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。
2.陰性對(duì)照：選用已知染色陰性的組織切片染色，其結(jié)果應(yīng)為陰性，一般來說，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行，或其中有陽(yáng)性染色結(jié)果時(shí)才有意義。
十一、免疫組織化學(xué)染色后的背景復(fù)染
免疫組織化學(xué)技術(shù)的另外一個(gè)特點(diǎn)是抗體在組織中的定位準(zhǔn)確。因此，免疫組織化學(xué)染色后需要復(fù)染細(xì)胞核，以將組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示出來，使免疫組織化學(xué)染色結(jié)果定位清晰
。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果根據(jù)顯色劑的不同而不同，有棕色、藍(lán)色和紅色，復(fù)染細(xì)胞核的顏色也因染液不同而不同，一般有藍(lán)色（蘇木素）、綠色（甲基綠）和紅色（核固紅）三
種。應(yīng)根據(jù)顏色對(duì)比清晰的原則進(jìn)行搭配，常用的是DAB顯色呈棕色，Mayer~s蘇木素復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色。甲基綠復(fù)染細(xì)胞核，顏色鮮艷，特別適用于顯微照相，但容易腿色。
十二、免疫組化染色結(jié)果的觀察
1. 陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)定位在細(xì)胞中相應(yīng)的部位，在細(xì)胞膜表達(dá)的抗原陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)
定位在細(xì)胞膜上，在其他部位的陽(yáng)性反應(yīng)均為非特異性染色。不當(dāng)?shù)慕M織切片前處理會(huì)導(dǎo)致抗原在組織細(xì)胞中定位的改變。根據(jù)所檢測(cè)抗原的不同，抗原分別定位在：（1）細(xì)胞膜
如LCA和UCHL1等。（2）細(xì)胞漿如Keratin和Lysozyme等
（3）細(xì)胞核如PCNA和ER、PR等
2. 不當(dāng)?shù)慕M織切片前處理有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。
3. 組織的周邊、刀痕、皺折等部位往往呈陽(yáng)性反應(yīng)，但絕大多數(shù)都是非特異性染色。
4. 染色結(jié)果呈陰性并非都是抗原不表達(dá)，要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關(guān)。
5. 組織切片背景深與下列因素有關(guān)：
（1）第一抗體濃度太高或孵育時(shí)間過長(zhǎng)，溫度過高。
（2）顯色劑DAB濃度過高或H2O2太多。
（3）正常血清封閉之后、滴加第一抗體之前用了PBS洗。
（4）抗體純度不高。
（5）抗體孵育切片后沖洗不干凈。
十三、抗體的保存和稀釋
抗體應(yīng)于低溫保存，第一抗體可分成小包裝于-20℃保存，使用時(shí)存放在4℃，不宜反復(fù)存放于4℃和-20℃之間。檢測(cè)試劑盒一般存放于4℃，不宜于-20℃保存，如長(zhǎng)時(shí)間不用
可存放于-20℃，解凍使用后則不能再存放于0℃以下，因?yàn)榉磸?fù)凍融使得與抗體結(jié)合的酶容易離解，導(dǎo)致檢測(cè)的敏感度降低。
濃縮的抗體在染色前應(yīng)根據(jù)說明書要求或自行摸索出的最佳工作濃度進(jìn)行稀釋。日常工作量不多時(shí)，可將抗體稀釋至1:5-20，染色前再稀釋成工作液。濃縮液抗體保存的時(shí)間
較長(zhǎng)，反之稀釋后的抗體保存的期限較短，如使用即用型抗體，經(jīng)過一定時(shí)間后應(yīng)注意其效價(jià)是否有所降低，避免出現(xiàn)假陰性染色�？贵w稀釋液可用商品化的抗體稀釋液，也可以
用0.01mol/L PBS（ pH7.4），在PBS中加入1％BSA和10％正常血清后稀釋抗體，對(duì)減輕非特異性背景染色有所幫助。
十四、其它注意事項(xiàng)
1．石蠟切片脫蠟要徹底。
2．抗體孵育時(shí)間隨孵育溫度升高而減少，但一般不超過37℃；如果不是由于診斷急需，一抗置于4℃孵育過夜也是一種較佳的選擇。
3．滴加抗體應(yīng)完全覆蓋組織，避免引起組織邊緣效應(yīng)。
