免疫金銀染色方法敏感、簡(jiǎn)便、省時(shí)、安全可靠，葡萄球菌A蛋白（SPA）金標(biāo)記四步法是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的更為敏感的一種新方法。SPA和許多哺乳類(lèi)動(dòng)物IgG具有親和性，且它們之間的連接不會(huì)干擾抗原——抗體的結(jié)合。簡(jiǎn)單的SPA金標(biāo)記二步法后，第三步用抗SPA與SPA金表面分子通過(guò)Fab或 Fc段相結(jié)合，結(jié)果結(jié)合更多的膠體金顆粒，再通過(guò)銀增強(qiáng)，使原始信號(hào)得到幾何級(jí)放大，其染色原理見(jiàn)圖。

雙PAG免疫金銀染色原理

（一）染色流程：

（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.05mol/L（pH7.4）TBS洗3×3min.

（2）0.1%胰蛋白酶37℃消化20min,或抗原修復(fù)20min（98℃），自然冷卻至室溫。

（3）0.05mol/L（pH7.4） TBS洗3×3min.

（4）1%EA（卵蛋白）15min,不洗。

（5）適當(dāng)稀釋的特異抗體室溫4h或4℃孵育20h,或37C孵育30min.

（6）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗3×5min.

（7）0.02mol/L（pH7.4）TBS（內(nèi)含0.1%BSA）洗10min.

（8）1%EA 15min,不洗，滴加PAGlonm 1:40稀釋?zhuān)�室�?h,

（9）0.05mo!/L（pH7.4）TBS洗10min.

（10）兔抗SPAIgGl:400稀釋?zhuān)?7℃ 30min.

（11）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗10min.

（12）滴加PAGlonm 1:60稀釋?zhuān)�室�?h,或37℃ 30min.

（13）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗10min.

（14）1%戊二醛洗10min.

（15）雙蒸水洗5min.

（16）1%明膠洗5min.

（17）銀避光顯影8~15min.

（18）雙蒸水洗15min.

（19）固定：用顯影定影液（1:4或1:10）固定5min,也可以用15%硫酸鈉-20%硫代硫酸鈉混合液固定1~3rain，或用1%戊二醛固定5min,50℃溫水洗3~6min.

（20）襯染：核固紅襯染3min或甲基綠襯染3min.

（21）常規(guī)脫水，樹(shù)膠封片。

（22）鏡檢：陽(yáng)性物質(zhì)呈黑色或黑褐色，顆粒分布于抗原-抗體反應(yīng)部位；背景較干凈，呈紅色。

（二）雙PAG法的敏感性

應(yīng)用本法對(duì)keratin、AFP、HBsAg、FN、SOD、HCG、F8、P53等組織抗原的定位，連續(xù)4gm石蠟切片，同時(shí)用IGSS和雙 PAG法，不同的一抗稀釋度，結(jié)果雙PAG法要比IGSS法敏感5~8倍，抗體的稀釋度從1:  （1000~5000）提高到1:  （10000-50000），大大節(jié)約了第一抗體。尤其組織細(xì)胞內(nèi)抗原性較弱，抗原丟失嚴(yán)重，應(yīng)用雙PAG法均能得到有效的檢測(cè)，陽(yáng)性檢測(cè)率和陽(yáng)性強(qiáng)度有了明顯的提高。某些抗原用單一的SPA金標(biāo)探針對(duì)某些抗原只能獲得低強(qiáng)度的染色，當(dāng)用雙PAG法時(shí)可獲得強(qiáng)的特異性染色。