羅氏轉(zhuǎn)染試劑

摘要： 一般情況下哺乳動物細(xì)胞攝取并表達(dá)外源基因的效率很低，科學(xué)家們因此開發(fā)了轉(zhuǎn)染技術(shù)來克服這個(gè)障礙。然而并不是每次轉(zhuǎn)染都能成功，轉(zhuǎn)染成功率可以說已經(jīng)成為了限制性的瓶頸問題，如何提高轉(zhuǎn)染成功率？如何抓住轉(zhuǎn)染成功的關(guān)鍵？看看羅氏的專家怎么說？

引言

在通常情況下，哺乳細(xì)胞攝取并表達(dá)外源基因的效率很低，這主要是由于真核細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜是阻止帶電荷分子進(jìn)入細(xì)胞的巨大障礙。目前人們已開發(fā)了數(shù)種轉(zhuǎn)染技術(shù)來克服這個(gè)障礙。有了這些技術(shù)后，采用DNA或RNA轉(zhuǎn)染的方法來研究培養(yǎng)細(xì)胞中的基因表達(dá)就成為了生物學(xué)研究中的常規(guī)手段。

簡而言之，轉(zhuǎn)染是指將DNA、RNA、蛋白質(zhì)或者其他大分子輸送進(jìn)入真核細(xì)胞內(nèi)。使用轉(zhuǎn)染技術(shù)的目的包括對基因調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能等進(jìn)行研究。

現(xiàn)已建立并完善了數(shù)種不同的技術(shù)將各種分子，尤其是核酸輸送進(jìn)入真核細(xì)胞內(nèi)。這些轉(zhuǎn)染技術(shù)是基于三種不同的策略來實(shí)現(xiàn)的。

沒有一種轉(zhuǎn)染試劑是可以普遍適用的 

并不是所有的轉(zhuǎn)染技術(shù)都能適用于所有類型的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)。采用不同的轉(zhuǎn)染技術(shù)在所能獲得的基因表達(dá)水平方面差異很大。

此外，沒有一種單一的技術(shù)能夠適合于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)所用不同細(xì)胞體系的多樣性。每種轉(zhuǎn)染技術(shù)都會有其自身的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，而取決因素則包括，例如，需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型（對于不同的細(xì)胞系尤其如此），需要被轉(zhuǎn)染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì)），或者甚至是對轉(zhuǎn)染應(yīng)用高通量的要求等都會有所影響。但無論在何種情況下，轉(zhuǎn)染成功都取決于轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性、以及重現(xiàn)性這幾個(gè)要素。為確保轉(zhuǎn)染的高效性，您需要選擇一種可靠的轉(zhuǎn)染技術(shù)及轉(zhuǎn)染試劑，使之在您的細(xì)胞培養(yǎng)條件下能夠發(fā)揮最佳效果。

為了選擇最符合您需要的轉(zhuǎn)染試劑，您需要檢索有關(guān)您所需的特定細(xì)胞類型或使用方式的現(xiàn)有文獻(xiàn)資料，考察不同試劑的特點(diǎn)，如果可能的話，還要采用有關(guān)試劑所推薦的方案對幾種不同的試劑進(jìn)行測試。

針對特定使用方式的注意點(diǎn)

細(xì)胞生理

為了研究細(xì)胞生理，或用細(xì)胞進(jìn)行目標(biāo)驗(yàn)證，要注意確保所使用的轉(zhuǎn)染過程本身不會改變研究目標(biāo)的效應(yīng)途徑，或者如果有所改變的話，其改變程度也應(yīng)盡量減小。如果您所用的轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞有害，那么就很難區(qū)分所產(chǎn)生的效應(yīng)到底是出自轉(zhuǎn)染過程本身還是被轉(zhuǎn)染的特定基因。正因?yàn)檫@個(gè)原因，一定要同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體或含有無關(guān)基因的載體作為空白對照。僅有如此您才能對目標(biāo)基因所產(chǎn)生的效應(yīng)做出評價(jià)。

在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，您總是希望能獲得最佳的轉(zhuǎn)染效率，并且盡量減小相差顯微鏡下可見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。在使用我們的兩種轉(zhuǎn)染試劑FuGENE® 6和FuGENE® HD對細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)染研究中，我們采用了微陣列分析方法，來確定基因表達(dá)上調(diào)或者下降的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)我們的這些試劑和其他同類試劑（見參考文獻(xiàn)）相比較，對試驗(yàn)細(xì)胞所產(chǎn)生的非目標(biāo)效應(yīng)要少許多。

使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來生產(chǎn)蛋白

以往為了獲得蛋白質(zhì)的高表達(dá)產(chǎn)量，您必須先轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后挑選一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行蛋白的擴(kuò)增和富集。而挑選這樣一個(gè)細(xì)胞系往往需要花費(fèi)數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間，這既可能是由于試劑的細(xì)胞毒性也可能是由于轉(zhuǎn)染的低效率。如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑具有細(xì)胞毒性，那么只有少數(shù)細(xì)胞能夠存活，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的產(chǎn)量很低。而如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染成功的細(xì)胞太少，那么那些未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞其生長速度大大超過轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，其結(jié)果同樣也只能產(chǎn)生少量的目標(biāo)蛋白。

現(xiàn)在，為了獲得蛋白質(zhì)高表達(dá)，您有了一個(gè)更好的選擇，即使用一種溫和的可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑。使用FuGENE® HD轉(zhuǎn)染試劑，您可以在轉(zhuǎn)染后3-7天獲得高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)，因?yàn)檫@種轉(zhuǎn)染試劑幾乎沒有細(xì)胞毒性，可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)的細(xì)胞，并且每種能被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都能獲得高產(chǎn)量。

但仍有一些蛋白能獲得比其他蛋白更高的產(chǎn)量。因此，現(xiàn)將一些影響到蛋白表達(dá)高水平的關(guān)鍵因素分列如下：

細(xì)胞系（有些類型的細(xì)胞比其他細(xì)胞產(chǎn)量高） 
質(zhì)粒骨架（例如：增強(qiáng)子，啟動子，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件） 
目標(biāo)蛋白（有些蛋白很難獲得高表達(dá)量）
目標(biāo)蛋白的cDNA序列（例如：密碼子的優(yōu)化）
培養(yǎng)條件（營養(yǎng)物，代謝廢物，轉(zhuǎn)染抑制物）

當(dāng)這些因素都得到優(yōu)化，并加入合適配比和數(shù)量的轉(zhuǎn)染復(fù)合物（轉(zhuǎn)染試劑－質(zhì)粒）后，就可獲得至少達(dá)到平均表達(dá)水平的穩(wěn)定表達(dá)克隆。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的比較

制備一種穩(wěn)定細(xì)胞系的第一步是選擇一種同時(shí)含有選擇性標(biāo)記物和目標(biāo)基因的載體。選擇性標(biāo)記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或者酶來幫助細(xì)胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因。

一旦選好了質(zhì)粒載體，無論短暫或者穩(wěn)定表達(dá)都采用一樣的轉(zhuǎn)染方法。被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至少要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，直到加入選擇性試劑。這樣就使細(xì)胞有時(shí)間表達(dá)足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用。細(xì)胞于是在加有選擇性試劑的培養(yǎng)基中生長。那些未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞即被殺死。而只有那些成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠生長。有的時(shí)候，還可以將選擇性試劑持續(xù)加入到培養(yǎng)基中，以維持對細(xì)胞的選擇壓力。


目前羅氏應(yīng)用科學(xué)部所提供的轉(zhuǎn)染試劑

羅氏應(yīng)用科學(xué)部為多種轉(zhuǎn)染方法提供不同的試劑。下面對這些試劑作一概述。

多組分試劑

這是一種創(chuàng)新的多組分試劑，同時(shí)具有高轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性，因此無需再進(jìn)一步優(yōu)化。羅氏應(yīng)用科學(xué)部可提供的多組分轉(zhuǎn)染試劑有若干種：


FuGENE® 6 轉(zhuǎn)染試劑（目錄編號. 11814443001，11815091001, 11988387001，和11988484001）

FuGENE® 6 轉(zhuǎn)染試劑是一種優(yōu)化的含有脂類和其他專利化合物的混合物。這種試劑同時(shí)具有高轉(zhuǎn)染效率和極低的細(xì)胞毒性。同基于陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑相比，它首次使用就可使轉(zhuǎn)染成功（并不需要事先優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件）。采用這種試劑已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)染了超過700多種細(xì)胞，其中還包括很多原代細(xì)胞。

因?yàn)樗�很容易使用，同時(shí)又很溫和，所以適用于新近 經(jīng)胰蛋白酶消化所得的細(xì)胞，非常適合于一系列的高通量篩選。

FuGENE® H D 轉(zhuǎn)染試劑（目錄編號 04709691001，04709705001, 04709713001）

FuGENE® HD 轉(zhuǎn)染試劑是一種“新生代”轉(zhuǎn)染試劑，不含任何動物或人體來源的成分，在室溫下穩(wěn)定，并經(jīng)過無菌過濾處理（0.1µm）。FuGENE® HD 轉(zhuǎn)染試劑是一種多用途試劑，適合不同的應(yīng)用場合。其優(yōu)點(diǎn)如下：

它有一套便利的優(yōu)化方案，使之能夠轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞范圍很廣，包括從動物到昆蟲的多種細(xì)胞類型，而細(xì)胞毒性卻非常小。
對許多經(jīng)其他試劑轉(zhuǎn)染效果不佳的細(xì)胞系而言，使用這種試劑的效率卻極好，比如MCF-7、RAW 264.7、PC-3、HeLa、MA-10、HepG2、SH-SY5Y、A7r5、STO、SCC-61、STSAR-90、SQ20B、T98G、A375、A549和干細(xì)胞等。

它尤其對于長時(shí)間的蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)有效，這是因?yàn)樗�能轉(zhuǎn)染蛋白表達(dá)常用的許多適于貼壁或懸浮的細(xì)胞系（如，CHO-K1，HEK 293，和昆蟲細(xì)胞等）。

它使細(xì)胞無論在含有血清的培養(yǎng)基還是在不含血清的培養(yǎng)基中生長，都能夠表達(dá)高水平的重組蛋白。

FuGENE® H D 轉(zhuǎn)染試劑甚至可使細(xì)胞在高濃度的血清（最高達(dá)100％）中表達(dá)高水平的蛋白。因此，在這類情況下就可以選擇FuGENE® H D 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行研究。

X-tremeGENE siRNA 轉(zhuǎn)染試劑（目錄編號 04476093001，04476115001）

RNA干擾（RNAi）技術(shù)是抑制某種特定基因表達(dá)的一種有效方法。RNAi 實(shí)驗(yàn)所需的轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)當(dāng)是針對向哺乳動物輸送siRNA所特別優(yōu)化的。這種試劑就是X-tremeGENE siRNA 轉(zhuǎn)染試劑，它能與siRNA形成復(fù)合物并將其有效地輸送進(jìn)入真核細(xì)胞。該試劑能有效轉(zhuǎn)染很多中常用地細(xì)胞系，包括HeLa，NIH 3T3，HEK-293，CHO-K1，COS-7，和若干種“轉(zhuǎn)染困難戶”細(xì)胞系。在以共轉(zhuǎn)染為基礎(chǔ)的RNAi 實(shí)驗(yàn)中，X-tremeGENE siRNA 轉(zhuǎn)染試劑既可以支持蛋白高表達(dá)又能進(jìn)行有效的基因敲除。

注：該試劑具有低細(xì)胞毒性。它還可以在血清存在或不存在的情況下都發(fā)揮極佳的作用；在轉(zhuǎn)染前和加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物之后它都不需要更換培養(yǎng)基。 

陽離子脂質(zhì)體試劑

如果將一種陽離子脂類和一種中性脂類混和，就會形成多層脂質(zhì)體囊，由于其陽離子分子具有高度正電性的氨基，因此該脂質(zhì)體囊所攜帶靜電荷為正。核酸可吸附到這些囊泡上并很可能通過脂質(zhì)體與漿膜間形成的內(nèi)吞囊泡而得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。經(jīng)仔細(xì)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件后，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)要比早期使用的轉(zhuǎn)染方法更為有效也更加簡便。羅氏應(yīng)用科學(xué)部可提供三種脂質(zhì)體類試劑用于轉(zhuǎn)染DNA、RNA和寡核苷酸：


DOTAP 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（目錄編號. 11202375001，11811177001）
DOTAP是一種單陽離子試劑。

DOSPE R 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（目錄編號. 11811169001，11781995001）
DOSPER是一種聚陽離子試劑。

X-tremeGENE Q2 轉(zhuǎn)染試劑（目錄編號. 03045595001，03036421001）
X-tremeGENE Q2 轉(zhuǎn)染試劑經(jīng)設(shè)計(jì)并優(yōu)化用于在K-562和Jurkat細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和蛋白高水平表達(dá)。
注：該專利試劑以干態(tài)脂質(zhì)膜的形式供應(yīng)。