細(xì)胞凋亡是一種在基因控制下的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，通常表現(xiàn)為核濃縮，起皺，膜發(fā)泡以及 DNA 片段化。WB 是研究細(xì)胞凋亡機(jī)理的基本方法之一，但是 WB 也不是誰(shuí)都能做成功的，因?yàn)橛锌赡苣愕牡谝徊骄妥鲥e(cuò)了！用 WB 做細(xì)胞凋亡研究樣品制備是第一步，樣品制備方法至關(guān)重要否則會(huì)得到錯(cuò)誤的結(jié)果和結(jié)論。
樣品制備，看你是不是這樣做的：
自配裂解液或者購(gòu)買 RIPA，加上樣品研磨啊研磨，孵育啊孵育，然后離心扔掉沉淀（RIPA 不可溶組分），取上清（RIPA 可溶組分）進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。
對(duì)對(duì)對(duì)！都是這么做啊，扔了取上清！
且慢，我們?nèi)拥袅�，扔掉了，扔掉了一些啥？要不要緊，影響細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不？
例一． Zapata et al., （1998）. Granzyme Release ａnd Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.
Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中 caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的 Caspase-3 由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase 的活性明顯下降。
研究方法：
1.分別使用 RIPA 和 2%SDS + 超聲提取未激活 T 淋巴細(xì)胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴細(xì)胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解細(xì)胞提取總蛋白
2.WB 進(jìn)行 caspase-3, caspase-7, parp ａnd GD1 檢測(cè)
主要發(fā)現(xiàn)：
p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中卻不存在。證明了 RIPA buffer 提取蛋白時(shí)會(huì)人工激活 caspase-3 ａnd caspase-7。用 Laemmli 緩沖液加超聲處理可進(jìn)一步從 RIPA 不可溶性組分中提取出蛋白。
