Rich 教授是膠質(zhì)母細胞瘤領域的專家，可是對于這種侵襲性極強，中位生存期只有 15 個月 [3]，5 年生存率在 6% 左右，被稱為「癌癥之王」的癌癥，他也束手無策。

在 Rich 教授看來，這可能是研究的方法出了問題。

「傳統(tǒng)藥物研發(fā)是從體外培養(yǎng)癌細胞開始的，然后做高通量篩選�！筊ich 教授在論文中表示，「這種方法篩選出來的藥物遠遠算不上成功，在膠質(zhì)母細胞瘤領域尤甚�！�

藥物研發(fā)路上的這條攔路虎，把 Rich 教授逼到了另一條道路，盡量模擬腫瘤的原生環(huán)境，然后在這種條件下篩選藥物作用靶點。

借助于 Johannes Zuber 博士在冷泉港開發(fā)的 RNAi 技術 [1]，Rich 教授團隊開發(fā)出了一個在小鼠體內(nèi)篩選藥物靶點的新技術平臺。

采用這個技術，他們找到了膠質(zhì)母細胞瘤在腫瘤微環(huán)境下生存所必需的 57 個關鍵基因，讓人吃驚的是，這 57 個關鍵基因與體外培養(yǎng)篩選找到的基因沒有一個是重合的。當他們靶向其中一個叫 JMJD6 的基因時，超過 1 / 4 的膠質(zhì)母細胞瘤模式小鼠，生存期至少延長了 67%！顯然，Rich 教授打開了癌癥藥物研發(fā)的一個新方向。相關的研究成果，于 7 月 5 日刊登在《自然》上 [2]。

腫瘤的生長環(huán)境是極其惡劣的，營養(yǎng)不足、空間有限，壓力山大。相較而言，生活在培養(yǎng)基里面的癌細胞就幸福多了，營養(yǎng)充分、條件適宜，無憂無慮、茁壯成長。在這兩種迥然不同的條件下，癌細胞所必需的生存技能顯然是不同的。靶向與腫瘤微環(huán)境有關的基因，這也是 Rich 教授想要改變研究策略的基本出發(fā)點。

基于腫瘤在體內(nèi)（上）生長和體外（下）生長環(huán)境不同，開發(fā)的 RNAi 篩選技術示意圖

這種篩選技術的流程分為以下幾個步驟：首先，是構建短發(fā)夾 RNA（short hairpin RNA，shRNA）庫。shRNA 能夠抑制靶基因的表達。研究人員將 shRNA 整合到帶有雙重熒光報告基因的載體上 [4]。他們構建了 1586 種 shRNA，靶向 406 個已知的染色質(zhì)及轉錄調(diào)節(jié)基因（每個基因對應 2 - 4 種 shRNA）。

然后，研究人員將患者的腫瘤細胞轉移到小鼠顱腔中，保證其在腫瘤微環(huán)境中生長，并將上述 shRNA 庫轉移至腫瘤細胞中。

之后是篩選帶有 shRNA 的腫瘤細胞。當 shRNA 成功轉移到細胞內(nèi)時，會發(fā)出綠色的熒光，根據(jù)綠色熒光，就可以出篩選帶有 shRNA 的腫瘤細胞了。

接下來是構建篩選平臺：研究人員將篩選出的腫瘤細胞分為兩部分。一部分在體外培養(yǎng)，另一部分移植到小鼠顱腔中（體內(nèi)培養(yǎng)）。兩種培養(yǎng)方式分別設立實驗組和對照組。

研究人員給實驗組施加化學藥物，這種藥物可以讓 shRNA 表達，還會讓第二種熒光（紅色熒光）報告基因表達。這樣，活躍表達 shRNA 的腫瘤細胞就會同時發(fā)出綠色熒光和紅色熒光，同時，這種 shRNA 的靶基因的表達也會受到抑制。而對照組不予處理，對照組的腫瘤細胞只能發(fā)出綠色熒光。

在生長到 3 周時，研究人員將小鼠，并從小鼠顱腔取出腫瘤組織進行分離，然后再將實驗組或對照組的細胞進行測序并對 shRNA 的表達進行了量化。

如果一種 shRNA 的靶基因對腫瘤細胞的存活是關鍵的，那么，在實驗組中這個靶基因受到抑制后，細胞就不能存活。相對于對照組，實驗組細胞中相應 shRNA 的量也就減少。通過比較實驗組和對照組同種 shRNA 含量的變化，研究人員就可以篩選出腫瘤細胞存活的關鍵基因了。

篩選方法示意圖

在比較體外培養(yǎng)和體內(nèi)培養(yǎng)的篩選結果后，研究人員們震驚了：兩種培養(yǎng)方式中，影響腫瘤細胞存活的關鍵基因幾乎沒有重疊！在體內(nèi)培養(yǎng)時，腫瘤細胞存活所需的 57 個基因，對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞存活來說，是不重要的。

進一步的分析發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)時腫瘤存活所需的關鍵基因多是跟細胞的代謝和大分子的合成有關，而體內(nèi)培養(yǎng)時所需的關鍵基因多是與轉錄調(diào)節(jié)有關，而這受到腫瘤微環(huán)境的影響。

為了找到膠質(zhì)母細胞瘤的治療靶點，研究人員選擇了這 57 個基因中的 12 個與腫瘤應對環(huán)境壓力有關的基因，進行了進一步的研究。其中的一個基因 JMJD6，可以調(diào)節(jié)許多基因的表達，而這些基因對腫瘤細胞的生存是極其重要的。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)母細胞瘤患者的腫瘤中，JMJD6 基因的表達量很高，并且病情越嚴重，JMJD6 基因的表達量也越高。

這讓研究人員很興奮，如果不讓這個基因表達，會出現(xiàn)怎樣的結果呢？于是他們將腫瘤細胞的 JMJD6 基因敲除，分別在體外、移植到小鼠顱腔中培養(yǎng)。

這次，又得到了可喜的結果：體外培養(yǎng)時，敲除 JMJD6 基因對腫瘤的生長或存活并沒有什么影響；但是，相比于沒有敲除 JMJD6 基因的腫瘤小鼠，敲除了 JMJD6 基因的腫瘤小鼠存活的時間更長了（對照組小鼠 60 天時全部死亡，超過 1 / 4 的實驗組小鼠存活時間大于 100 天）。敲除 JMJD6 基因，對體外培養(yǎng)（b）的腫瘤生長無影響，卻延長了小鼠的壽命。這真是太神奇了！正如本研究的第一作者 Tyler Miller 博士所說，「我們的研究結果提示，靶向腫瘤應對壓力的基因，要比靶向細胞增殖的基因，治療效果更好！這為膠質(zhì)母細胞瘤的治療開辟了新的途徑！」[5]

這種篩選方法，能夠更接近天然腫瘤環(huán)境， 針對此種方法篩選出的靶點開發(fā)的藥物，也將能給患者提供更好的療效。