纖毛是參與運(yùn)動(dòng)和外界信號(hào)感知的重要細(xì)胞器，其組裝和維持依賴于高度有序而保守的雙向鞭毛內(nèi)運(yùn)輸（intraflagellar transport，IFT）機(jī)制。胞質(zhì)動(dòng)力蛋白 2（cytoplasmic dynein-2）是介導(dǎo)反向運(yùn)輸?shù)鸟R達(dá)蛋白復(fù)合物，由~500 kD 的重鏈亞基和若干小的輔助亞基組成。2015 年，歐光朔研究組通過 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的條件性基因敲方法鑒定出部分胚胎發(fā)育必需的輔助亞基參與纖毛建成和 dynein- 2 組裝，并且呈現(xiàn)不同的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)向行為（Li et al., Journal of Cell Biology, 2015）。然而，dynein- 2 的核心成分——重鏈亞基是如何在纖毛中定位、運(yùn)動(dòng)以及被調(diào)控的并不清楚。

本研究利用基因組編輯技術(shù)對 dynein- 2 重鏈 CHE- 3 進(jìn)行了綠色熒光蛋白（GFP）基因敲入，首次在活體多細(xì)胞動(dòng)物中對 dynein- 2 重鏈進(jìn)行了觀察和分析。高分辨率活體實(shí)時(shí)成像結(jié)果顯示，dynein- 2 介導(dǎo)的反向 IFT 呈現(xiàn)三相模式，即在纖毛尖端區(qū)域，反向 IFT 速度約 1.2 μm/s，在纖毛中間區(qū)域，反向 IFT 達(dá)到 1.5 μm/s，而在纖毛基部，IFT 速度又下降至 1.2 μm/s。進(jìn)一步通過 CRISPR/Cas9 敲入疾病相關(guān)突變位點(diǎn)，課題組發(fā)現(xiàn) CHE- 3 尾部結(jié)構(gòu)域中 R295C 突變破壞這一運(yùn)動(dòng)模式，提示尾部結(jié)構(gòu)域及可能與之結(jié)合的輔助亞基或貨物對 dynein- 2 的運(yùn)動(dòng)具有精細(xì)的調(diào)控作用。通過對一系列截短突變形式的 GFP::CHE- 3 進(jìn)行定位分析，課題組發(fā)現(xiàn)重鏈亞基的纖毛定位依賴于其尾部結(jié)構(gòu)域、中間輕鏈、IFT 顆粒亞復(fù)合物 IFT-B。這些結(jié)果表明在正向運(yùn)輸過程中，dynein- 2 作為驅(qū)動(dòng)蛋白 kinesin- 2 的貨物，通過 IFT 顆粒與尾部結(jié)構(gòu)域被運(yùn)輸進(jìn)入纖毛。IFT 顆粒亞復(fù)合物 IFT- A 參與反向 IFT，但其對 dynein- 2 的調(diào)控作用仍不清晰。利用 GFP 免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）和質(zhì)譜分析，研究組克隆了尚未被發(fā)現(xiàn)的線蟲 IFT- A 成分 IFT43 蛋白，并發(fā)現(xiàn)在反向 IFT 過程中，IFT43 和 IFT139 可能通過連接 IFT 顆粒與 dynein- 2 重鏈的尾部結(jié)構(gòu)域，從而激活這一馬達(dá)蛋白。基于以上結(jié)果，課題組提出了纖毛中較為完整的 dynein- 2 的運(yùn)動(dòng)模型（圖 1）。

圖 1. 在線蟲中，同屬于驅(qū)動(dòng)蛋白 2 家族的驅(qū)動(dòng)蛋白 II 和 OSM-3/Kif17 共同作用介導(dǎo)正向運(yùn)輸過程。該過程中，dynein- 2 作為貨物被運(yùn)輸進(jìn)入纖毛。在纖毛尖端，IFT43 和 IFT139 通過連接 IFT 顆粒與 dynein- 2 重鏈的尾部結(jié)構(gòu)域，激活 dynein-2。不同的輔助亞基在纖毛中間區(qū)域轉(zhuǎn)向，并進(jìn)一步促進(jìn) dynein- 2 的運(yùn)動(dòng)。在纖毛基部，dynein- 2 可能通過過渡區(qū)（transition zone）以及其他因子的作用而減速。

論文的通訊作者是歐光朔教授，博士生易培珊是該文章的第一作者。相關(guān)蛋白質(zhì)質(zhì)譜工作得到了北京生命科學(xué)研究所董夢秋老師和李文君同學(xué)，清華質(zhì)譜平臺(tái)鄧海騰老師和張文浩同學(xué)的大力幫助。線蟲遺傳學(xué)中心（Caenorhabditis Genetics Center）為本研究提供了部分線蟲品系。本研究工作得到了生命科學(xué)聯(lián)合中心、科技部、國家自然科學(xué)基金委等相關(guān)機(jī)構(gòu)和 Newton Advanced Fellowship 的經(jīng)費(fèi)資助。