胚胎生殖細(xì)胞是精子和卵細(xì)胞在胚胎期的前體細(xì)胞，其正常發(fā)育對(duì)于遺傳信息在親代與子代之間的穩(wěn)定傳遞以及物種延續(xù)起著至關(guān)重要的作用。對(duì)人類胚胎期生殖細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程的深入研究能夠促進(jìn)我們對(duì)于生殖細(xì)胞發(fā)育異常、不孕不育等相關(guān)疾病的了解與治療。在過去幾年中，湯富酬課題組與喬杰課題組一直緊密合作，運(yùn)用微量細(xì)胞 DNA 甲基化組高通量測序和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組高通量測序等技術(shù)，首次在單堿基分辨率和全基因組水平，全面揭示了人類胚胎生殖細(xì)胞在多個(gè)關(guān)鍵發(fā)育階段的大規(guī)模 DNA 甲基化組重編程過程、及其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)了人類胚胎生殖細(xì)胞不同于小鼠胚胎生殖細(xì)胞的關(guān)鍵獨(dú)特特征。他們發(fā)現(xiàn)在 DNA 甲基化組重編程過程中，DNA 甲基化與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)生脫扣，這樣 DNA 甲基化在被大規(guī)模擦除過程中基因的轉(zhuǎn)錄基本不受影響，各種組蛋白共價(jià)修飾在此期間維持著轉(zhuǎn)錄組的高度穩(wěn)定性。相關(guān)研究成果以封面文章的形式發(fā)表在 2015 年 6 月的《Cell》雜志上。在此基礎(chǔ)上，兩個(gè)課題組繼續(xù)深入研究，采用優(yōu)化的微量細(xì)胞 NOMe-seq（全基因組核小體定位及 DNA 甲基化組測序）技術(shù)，系統(tǒng)分析了人類胚胎生殖細(xì)胞多個(gè)關(guān)鍵發(fā)育階段的染色質(zhì)狀態(tài)組的動(dòng)態(tài)變化。作為對(duì)照，他們也系統(tǒng)分析了對(duì)應(yīng)發(fā)育階段的小鼠胚胎生殖細(xì)胞的染色質(zhì)狀態(tài)組的動(dòng)態(tài)變化。通過進(jìn)化比對(duì)分析，揭示了人類和小鼠胚胎生殖細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)組、DNA 甲基化組參與基因表達(dá)調(diào)控的進(jìn)化保守性特征以及物種特異性特征。他們還發(fā)現(xiàn)了十幾萬個(gè)人類生殖細(xì)胞胚胎階段特異性的開放染色質(zhì)區(qū)域，推測其中大部分為全新的人類胚胎生殖細(xì)胞特異性激活的增強(qiáng)子調(diào)控元件，這為解析增強(qiáng)子對(duì)于人類生殖細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育的調(diào)控機(jī)理打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。相關(guān)研究成果已在線發(fā)表在 2016 年 11 月的《Cell Research》雜志上。雖然該研究團(tuán)隊(duì) 2015 年 6 月發(fā)表在《Cell》上的文章中已經(jīng)對(duì)人類胚胎生殖細(xì)胞及其微環(huán)境細(xì)胞的三百多個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，但是胚胎生殖細(xì)胞精確的發(fā)育歷程，特別是減數(shù)分裂階段的發(fā)育異質(zhì)性和核心基因表達(dá)特征還沒有被闡明。

圖 2：人類胚胎生殖細(xì)胞的發(fā)育過程概覽。

在上述研究的基礎(chǔ)上，湯富酬研究組與喬杰研究組繼續(xù)深入合作，運(yùn)用免疫磁珠細(xì)胞分離技術(shù)（MACS）、流式細(xì)胞分選技術(shù)（FACS）、以及優(yōu)化了的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)對(duì)從妊娠 4 周到 26 周的人類胚胎生殖細(xì)胞及其微環(huán)境細(xì)胞的兩千多個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序分析，并通過后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)對(duì)性腺中生殖細(xì)胞的分布與定位、以及細(xì)胞亞群的精確比例關(guān)系等關(guān)鍵特征進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。該項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)：

（一）定植到性腺后，人類雌性胚胎生殖細(xì)胞經(jīng)歷四個(gè)關(guān)鍵的發(fā)育階段：（1） 有絲分裂階段、（2） 視黃酸信號(hào)響應(yīng)階段、（3） 減數(shù)分裂前期階段、（4） 原始卵泡生成階段。定植到性腺后，人類雄性胚胎生殖細(xì)胞經(jīng)歷兩個(gè)關(guān)鍵的發(fā)育階段：（1） 有絲分裂階段、（2） 有絲分裂阻滯階段。有趣的是，妊娠后 18 周的胚胎卵巢中就已經(jīng)開始出現(xiàn)原始卵泡階段的生殖細(xì)胞，并且在從 18 周到 26 周的胚胎卵巢中，從早期有絲分裂階段直到晚期原始卵泡階段所有四個(gè)發(fā)育階段的生殖細(xì)胞在同一個(gè)性腺中共存。類似的，從 13 周到 25 周的胚胎睪丸中，早期有絲分裂階段和晚期有絲分裂阻滯階段的生殖細(xì)胞在同一個(gè)性腺中共存。這表明人類胚胎生殖細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程在時(shí)間上是不同步的，會(huì)經(jīng)過一個(gè)復(fù)雜而有序的異步發(fā)育過程。

（二）準(zhǔn)確鑒定出了人類胚胎雌性性腺中的 4 種關(guān)鍵類型的微環(huán)境細(xì)胞：性腺內(nèi)皮細(xì)胞、早期顆粒細(xì)胞、晚期顆粒細(xì)胞、以及壁顆粒細(xì)胞。同時(shí)也準(zhǔn)確鑒定出了人類胚胎雄性性腺中的 4 種關(guān)鍵類型的微環(huán)境細(xì)胞：性腺內(nèi)皮細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)前體細(xì)胞、以及成熟間質(zhì)細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，系統(tǒng)鑒定了這 8 種性腺微環(huán)境細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征，表面標(biāo)志，信號(hào)通路活性，以及核心轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。

（三）在單細(xì)胞水平系統(tǒng)分析了以上各種類型性腺細(xì)胞在發(fā)育過程中重要的基因表達(dá)模式，并且運(yùn)用 ARACNe （the Algorithm for the Reconstruction of Accurate Cellular Networks） 方法分析鑒定出在各個(gè)關(guān)鍵發(fā)育階段雌性和雄性生殖細(xì)胞中可能起核心調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。例如，MALE 和 ZGLP1 在視黃酸信號(hào)響應(yīng)階段的雌性生殖細(xì)胞中可能起關(guān)鍵調(diào)控作用；FIGLA 和 STAT1 對(duì)于原始卵泡生成階段的雌性生殖細(xì)胞的發(fā)育可能至關(guān)重要。

（四）準(zhǔn)確鑒定出人類胚胎生殖細(xì)胞與性腺微環(huán)境細(xì)胞之間通過 BMP 和 NOTCH 等信號(hào)通路進(jìn)行相互調(diào)控，協(xié)同維持性腺發(fā)育的穩(wěn)定性和連續(xù)性。特別是該研究發(fā)現(xiàn)在同一個(gè)胚胎中的早期階段生殖細(xì)胞與晚期階段生殖細(xì)胞之間通過 NORDAL 等信號(hào)通路相互作用，共同維持二者之間的動(dòng)態(tài)平衡。

（五）視黃酸信號(hào)通路的精確調(diào)控對(duì)于生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂至關(guān)重要。通過對(duì)視黃酸信號(hào)通路中的相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)的分析，該研究首次發(fā)現(xiàn)：合成視黃酸的基因 RDH10 在雌性生殖細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于雄性生殖細(xì)胞，降解視黃酸的基因 CYP26A1 在視黃酸信號(hào)響應(yīng)階段和減數(shù)分裂前期階段的雌性生殖細(xì)胞中上調(diào)。該研究表明視黃酸的快速合成與及時(shí)降解之間的精確動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于人類雌性生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂起重要調(diào)控作用。

（六）通過對(duì)與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，該研究發(fā)現(xiàn) NANOS2，CDKN2B 和 CDK6 等基因?qū)τ谌祟惻咛テ谛坌陨�殖�?xì)胞進(jìn)入有絲分裂阻滯階段可能起關(guān)鍵調(diào)控作用。

（七）運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)對(duì) 18 周人類胚胎卵巢組織中的四種主要類型生殖細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：隨著發(fā)育的進(jìn)行，人類胚胎生殖細(xì)胞的大小會(huì)逐漸增大，由有絲分裂階段的 8 -10 μm 到原始卵泡發(fā)生階段的 23-28 μm；有絲分裂期和視黃酸信號(hào)響應(yīng)期的胚胎生殖細(xì)胞大多分布在卵巢皮質(zhì)的周邊區(qū)域，減數(shù)分裂前期和原始卵泡生成期的胚胎生殖細(xì)胞的分布則更靠近卵巢中心（髓質(zhì)）的區(qū)域；四種胚胎生殖細(xì)胞數(shù)量的比例依次是 25%，40%，25%，10%。而 18 周的胚胎睪丸組織中有絲分裂階段和分裂阻滯階段的生殖細(xì)胞的比例分別為 40% 和 60%。

該研究對(duì)人類胚胎生殖細(xì)胞在妊娠 4 周到 26 周的長達(dá)五個(gè)月的發(fā)育關(guān)鍵期的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了全面、系統(tǒng)、深入的解析與闡釋，深化了對(duì)于人類生殖系細(xì)胞的有絲分裂、減數(shù)分裂、卵泡發(fā)生、細(xì)胞遷移、性別分化、生殖細(xì)胞 - 微環(huán)境細(xì)胞互作等一系列關(guān)鍵的生殖生物學(xué)過程的理解；特別是加深了對(duì)于生殖系 - 非生殖系細(xì)胞在性腺發(fā)育過程中的互動(dòng)與協(xié)同調(diào)控機(jī)理的理解。

該研究對(duì)高度動(dòng)態(tài)但又精確協(xié)調(diào)的核心轉(zhuǎn)錄因子以及信號(hào)通路的解析為多能性干細(xì)胞體外定向分化為生殖細(xì)胞研究提供了非常有價(jià)值的線索。該項(xiàng)研究描繪的體內(nèi)正常生理情況下人類胚胎生殖細(xì)胞的發(fā)育歷程將為生殖細(xì)胞相關(guān)疾�。ㄈ绮辉胁挥�和畸胎瘤等）的診斷和治療提供路標(biāo)。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生李莉、董驥和北醫(yī)三院生殖中心閆麗盈博士為該論文的并列第一作者。湯富酬研究員和喬杰教授為該論文的共同通訊作者。該項(xiàng)研究得到了國家自然科學(xué)基金、國家基礎(chǔ)研究計(jì)劃、北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)、國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、以及北大 - 清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。

圖 3：人類雌性胚胎生殖細(xì)胞動(dòng)態(tài)基因表達(dá)模式。

圖 4：人類雄性胚胎生殖細(xì)胞動(dòng)態(tài)基因表達(dá)模式