目前小RNA深度測序的文庫構(gòu)建通常要幾百納克（ng）總RNA，難以對配子和胚胎等難以大量獲取的生物學樣品中的小RNA表達譜進行研究。

該研究通過優(yōu)化基于連接反應的小RNA文庫構(gòu)建方法，使得總RNA用量降低了幾十倍，僅需要10納克總RNA即可在Illumina測序儀上實現(xiàn)對小RNA的深度測序，為研究配子、胚胎和各種干細胞中的小RNA提供了重要技術(shù)支撐。

圖示： 小鼠卵細胞和早期胚胎中微量小RNA深度測序方法原理及其測序結(jié)果。(A)微量小RNA深度測序cDNA文庫構(gòu)建流程圖。(B)小鼠卵細胞以及早期胚胎發(fā)育各個時期的樣本。(C)不同樣本中小RNA的組成及長度分布圖。小鼠CD4+ T細胞(CD4)是體細胞對照。

該研究利用優(yōu)化的方法系統(tǒng)解析了小鼠卵子到受精后8細胞胚胎發(fā)育過程中的小RNA動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)小鼠卵子和早期胚胎主要包含三類小RNA：endo-siRNA、piRNA和miRNA。受精卵中的這三類小RNA絕大多數(shù)來源于卵子，由精子帶入卵子的小RNA不足幾百分之一。隨著胚胎的發(fā)育，母源endo-siRNA和piRNA逐漸被緩慢降解。而母源miRNA的降解較快，主要發(fā)生在胚胎2細胞期前后，其中有近20%的miRNA 3’末端被加上了一個或四個腺苷酸（A），其降解速率與未被腺苷酸化的miRNA相比明顯減緩，推測可能3’末端腺苷酸化發(fā)揮了保護作用，使某些miRNA免于在母型至合子型轉(zhuǎn)化中被快速清除。合子中新表達的miRNA最早出現(xiàn)在受精卵第一次分裂前，并隨著胚胎的發(fā)育持續(xù)被激活表達，特別是進化保守的miRNA的表達量迅速上升。

研究人員進一步結(jié)合小鼠早期胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)miRNA在卵子到胚胎2細胞期中幾乎沒有降解靶基因mRNA的功能，而在4-8細胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能開始逐步恢復，并對合子激活表達的基因有明顯的靶向抑制作用。

以上研究不僅揭示了小鼠早期胚胎發(fā)育中miRNA的表達和降解規(guī)律，還發(fā)現(xiàn)了miRNA對靶基因的調(diào)控活性隨著胚胎發(fā)育而被動態(tài)調(diào)控的現(xiàn)象，對于理解miRNA在早期胚胎發(fā)育中的功能和機制具有重要意義。