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組織細(xì)胞甘油含量試劑盒說明書下載
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上傳時(shí)間：2017/9/5 10:31:06
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上 傳 者：齊一生物科技（上海）有限公司
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組織細(xì)胞甘油含量酶法測(cè)定試劑盒
描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。與游離脂肪酸
一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測(cè)指
標(biāo)，但檢測(cè)更加方便。本試劑盒采用優(yōu)化步驟，能
夠檢測(cè)實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油含量，線性范圍為
10-1200µmol/L。
原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-
磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化
氫；在過氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞
胺，其光密度值與甘油濃度成正比。
適用范圍：測(cè)定實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油濃度。
組成 (105次微板測(cè)定或30 次 1 ml比色杯測(cè)定)：
(1) 裂解液 50 ml
(2) R1試劑 16 ml
(3) R2試劑 4 ml
(4) 4 mmol/L甘油標(biāo)準(zhǔn)品1 ml
4 ºC，儲(chǔ)存3月。
所需設(shè)備：酶標(biāo)儀、生化分析儀或 721、722型可
見光分光光度計(jì)。*佳工作波長 550nm，如無此波
長建議優(yōu)先選用 570nm、次選 530、490nm。
一 組織細(xì)胞裂解
細(xì)胞(包括分化的脂肪細(xì)胞)裂解：
消化、離心收集細(xì)胞。或直接在培養(yǎng)皿內(nèi)裂解。
通常6孔板單孔約2x106
個(gè)細(xì)胞， 75cm2
瓶約1x107
細(xì)胞。按比例每1~2 x 106
細(xì)胞加0.1ml裂解液，
混勻，靜置10分鐘。
動(dòng)物組織裂解：
切記要預(yù)先將新鮮組織剪切稱重后再進(jìn)行保存。
組織凍存后再進(jìn)行解凍、剪切、稱重可能會(huì)產(chǎn)生
嚴(yán)重的測(cè)量誤差。離心管精確稱重，加入組織塊
后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計(jì)算組織重
量(約 100mg)。強(qiáng)烈建議按比例每 1mg 組織加
10µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而
產(chǎn)生的誤差。（注意；裂解液用量在 1ml 或更多
可保證有效的裂解與脂質(zhì)提�。Ｓ秒妱�(dòng)高速勻漿
器或手動(dòng)玻璃勻漿器破碎組織。（不推薦超聲方
法，因其不能完全和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)
整初始的組織細(xì)胞加入量），而后，靜置10分鐘。
二. 裂解液處理：
1. 取適量上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中， 進(jìn)行步驟
2 的操作。余下的裂解液可用 BCA 法蛋白定量
試劑盒(#P1511)進(jìn)行蛋白定量或－20ºC 儲(chǔ)存。
2. 70ºC 加熱10 分鐘滅活脂肪酶，可能出現(xiàn)絮狀沉
淀。
3. 室溫 5000rpm 離心 5 分鐘，上層清液即可用于
酶學(xué)測(cè)定。
三 工作溶液配制：按4:1比例，取4 ml試劑R1與
1 ml試劑R2混合即可， 立即使用或4ºC保存<1天，
變色棄去。 （注意：謹(jǐn)防來源不明但容易發(fā)生的甘
油污染，可來自操作者本人或標(biāo)準(zhǔn)品液體微粒濺射
等。）
四 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩
沖液一致的液體，將4 mM 甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為
1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125
µmol/L，通常取其中4~6管即可，注意設(shè)置0 濃度
對(duì)照反應(yīng)管。
五 甘油測(cè)定
1. 參見下表加樣。待測(cè)樣品體積 10µl，多加可能
會(huì)抑制反應(yīng)。
2. 37ºC 或 25ºC 反應(yīng) 10 分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在
60分鐘內(nèi)穩(wěn)定。
3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測(cè)定各
管OD值。
4. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度。
附Excel作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管OD 值為 y軸，標(biāo)
準(zhǔn)品濃度為 x 軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊
做圖向?qū)�，選擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠
標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢(shì)線-，點(diǎn)
擊-選項(xiàng)-，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R2
值-。
5. 以每mg 蛋白濃度或細(xì)胞數(shù)校正甘油含量。
加樣表
96孔微板測(cè)定 1 ml比色杯測(cè)定
空白管
標(biāo)準(zhǔn)品
樣品 空白管
標(biāo)準(zhǔn)品
樣品
蒸餾水µl 10 35
標(biāo)準(zhǔn)品µl 10 35
樣品µl 10 35
工作液µl 190 190 190 665 665 665
說明：
1. 維生素C>0.18g/L、 血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、
二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測(cè)試。
2. 紅細(xì)胞糖酵解時(shí)合成磷酸甘油影響測(cè)定。
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