活體細胞線粒體內膜功能/膜電位紅色熒光（TMRM）測定試劑是一種旨在通過四甲基羅丹明甲酯染料，選擇性地聚集在線粒體內呈現熒光染色，其熒光的增強或減弱說明線粒體膜電位的變化，即內膜電負性的增高或降低，來分析線粒體內膜功能的完整性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種線粒體制備物的功能檢測。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩(wěn)定。

技術背景

四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），為羅丹明衍生物陽離子染料，作為電勢測定（potentiometric）熒光探針：，具有親脂性，且細胞低毒和光穩(wěn)定； 第二，與線粒體內膜負電極結合而聚集；第三，容易進入細胞及其線粒體。四甲基羅丹明甲酯進入細胞后，被細胞內酯酶切離，產生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進入線粒體后，被線粒體俘獲，分布和結合在線粒體內膜上，呈現強烈熒光。線粒體膜電位的高低變化決定了TMRM的分布濃度。電位高，TMRM在線粒體的濃度高，顯示為強力紅色或桔紅色；反之，TMRM彌散在胞漿內，熒光減弱表明線粒體膜電位受到損害。 

產品內容

染色液（Reagent A）   100微升

稀釋液（Reagent B）    10毫升

清理液（Reagent C）    50毫升

強化液（Reagent D）1毫升

產品說明書1份

保存方式

保存清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細胞脫落收集

1.5毫升離心管：用于活體細胞線粒體染色的容器

微型臺式離心機：用于細胞收集的操作

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于活體細胞線粒體熒光定性分析

比色皿或96孔板：用于熒光定量分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于活體細胞線粒體熒光定量分析

細胞流式儀：用于活體細胞線粒體熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent B）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出10微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入890微升稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置，并標記為染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

一、直接法

1． 準備1個24孔細胞培養(yǎng)板的待測細胞，每孔鋪滿率達70％（約10⁵細胞數）

2． 小心抽去細胞培養(yǎng)液

3． 輕輕沿著孔壁加入1毫升 清理液（Reagent C）到細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4． （選擇步驟）加入50微升強化液（Reagent D），輕輕混勻

5． （選擇步驟）冰上孵育5分鐘

6． 小心抽去1毫升 清理液（Reagent C）

7． 加入450微升含有染色液（Reagent A） 和稀釋液（Reagent B）的染色工作液，覆蓋培養(yǎng)孔表面

8． 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）

9． 小心抽去450微升染色工作液

10． 小心加入500微升清理液（Reagent C）（注意：檢測前置于冰槽里）

11． 即刻在倒置熒光顯微鏡下進行觀察（濾波器激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm ）――可見

亮橘紅色熒光；如果強度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞

二、間接法

1． 準備1個12孔細胞培養(yǎng)板的待測細胞，每孔鋪滿率達70％（約30萬細胞數）

2． 小心移出細胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細胞）

3． 加入1毫升 清理液（Reagent C）到細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4． 小心移出1毫升 清理液（Reagent C）到15毫升錐形離心管（收集洗脫細胞）

5． 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)孔表面

6． 置入37℃培養(yǎng)箱1分種

7． 輕輕抖動培養(yǎng)板，使細胞脫落，然后加入1毫升完全細胞培養(yǎng)液

8． 移入15毫升錐形離心管

9． 放進 臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

10． 小心抽去上清液

11． 加入50微升清理液（Reagent C）

12． 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細胞顆粒群

13． 轉入到1.5毫升離心管或細胞流式儀專用測試管

14． 加入450微升含有染色液（Reagent A） 和稀釋液（Reagent B）的染色工作液

15． 輕度渦旋震蕩2秒

16． 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）

17． 放進 臺式微型離心機離心5分鐘，速度為300g

18． 小心抽去上清液

19． 加入500微升清理液（Reagent C）（注意：檢測前置于冰槽里）

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察 

1． 混勻后，移出50微升在載玻片上

2． 即刻進行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進行觀察（濾波器激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm） ――可見亮橘紅色熒光；如果強度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞

選擇二、細胞流式儀分析

1. 混勻后，即刻進行細胞流式儀分析：觀察50000個細胞以上

選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標儀測定

1． 混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里

2． 即刻進行熒光分光光度儀或熒光酶標儀測定（激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm），獲得相對熒光單位（RFU）：RFU值高表明線粒體膜電位正常

注意事項

1． 本產品為20次（0.5毫升工作液）操作

2． 操作時，須戴手套

3． 待測細胞建議不要過于饑餓或過度生長

4． 建議細胞染色完成后，即刻進行熒光檢測分析

5． 孵育時，避免光照

6． 健康細胞和線粒體呈現橘紅色；死亡或凋亡細胞及損傷線粒體呈現黯淡或無熒光

7． 本公司提供FCCP溶液，作為線粒體膜電位破壞分子，觀察熒光顯著減弱現象

8． 參考圖像

1） 熒光顯微鏡：左側為正常樣品；右側為處理樣品

2）細胞流式儀：上圖為正常樣品；下圖為FCCP處理樣品

9． 本公司提供系列線粒體試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產品經鑒定熒光清晰