雞嗜鉻蛋白A/胰素(CgA/Pancreastatin)ELISA試劑盒

ELISA：本法主要用于檢測IgM。由于IgM出現(xiàn)于感染早期，所以檢測出IgM，則可作為某種的早期診斷。ELISA根據(jù)所用標(biāo)記不同可分為標(biāo)記抗原、標(biāo)記、標(biāo)記抗ELISA等幾種，其中以標(biāo)記抗原ELISA比較有代表性，該的主要程序為：① 用抗u鏈（抗IgM重鏈）包被→37℃ 60分鐘后置4℃過夜，洗滌三次、拋干② 加待檢 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干③ 加酶標(biāo)抗原 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干④ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。

雞嗜鉻蛋白A/胰素(CgA/Pancreastatin)ELISA試劑盒

用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒操作步驟：

   實驗開始，請?zhí)崤渲煤盟�有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、孔、待測樣品孔�？瞻卓准訕悠废♂屢�100μl，余孔分別加品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。 為實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的品溶液。

2.棄去，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記加99μl生物素標(biāo)記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時可見品的3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

標(biāo)本的采集及保存：

• ：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)��?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

• ：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)��?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

• 細(xì)胞物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)��?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 (注：標(biāo)本溶血會影響**檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。)

• 標(biāo)本的稀釋原則：通過文獻(xiàn)檢索的了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。計算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

• 品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為濃度0 pg/ml，臨用15分鐘內(nèi)配制。 如配制150 pg/ml品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

• 生物素標(biāo)記的稀釋原則：臨用以生物素標(biāo)記稀釋液稀釋，稀釋根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標(biāo)記加990μl生物素標(biāo)記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配制。

• 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配置

用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

實驗結(jié)果計算：

    以物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出曲線，根據(jù)樣品的OD值由曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用物的濃度與OD值計算出曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

繪制曲線：在Excel工作表中，以品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

注意事項：

1.當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2.洗滌非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3.一次加樣時間**控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，建議使用排槍加樣。

4.請每次測定的同時做曲線，做復(fù)孔。

5.如標(biāo)本中待測含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請乘以稀釋倍數(shù)。

6.在配制品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7.底物請避光保存。

8.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

試劑盒性能

1．準(zhǔn)確性：品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2．靈敏度檢測濃度小于10 pg/ml。

3．特：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4．重復(fù)性：批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和15%。