用傳統(tǒng)低溫保存法保存細(xì)胞載體復(fù)合體, 可能破壞細(xì)胞和載體的黏附關(guān)系。研究報道, 細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與載體之間的互相接觸對維持細(xì)胞的存活率至關(guān)重要, 細(xì)胞生存能力下降的主要原因是由于細(xì)胞被分離后無法黏附, 從而引起大量細(xì)胞凋亡 , 只有黏附于載體上的細(xì)胞才能繼續(xù)增殖分化以及維持肝細(xì)胞正常的代謝功能。因此, 本文將培養(yǎng)于微載體Cytodex與Cytopore的肝細(xì)胞進(jìn)行低溫保存, 研究不同培養(yǎng)方式對復(fù)蘇后細(xì)胞與復(fù)合體黏附關(guān)系的影響, 探討肝細(xì)胞在微載體上的生長及肝細(xì)胞的代謝功能, 為研究細(xì)胞與微載體復(fù)合體的低溫保存機(jī)理提供有效方法。

    目前, 應(yīng)用較多的是美國GE公司實體微載體Cytodex與多孔微載體Cytopore等, 這些微載體可以提供足夠大的表面積, 使細(xì)胞在其表面及內(nèi)部黏附生長, 并使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入其空間。近年來, Cytodex與Cytopore系列載體常常應(yīng)用于細(xì)胞的高密度培養(yǎng), 取得了一些令人滿意的結(jié)果 , 但載體細(xì)胞高密度培養(yǎng)后如何進(jìn)行復(fù)合凍存目前研究較少, 傳統(tǒng)研究較多的是細(xì)胞凍存。如何低溫保存細(xì)胞與載體的復(fù)合體, 是我們要解決的一個問題。

    肝細(xì)胞是貼壁性細(xì)胞, 當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到一定數(shù)量時, 存在細(xì)胞接觸抑制效應(yīng), 阻礙細(xì)胞的繼續(xù)生長 。因此, 體外高密度培養(yǎng)肝細(xì)胞需要使用載體材料, 其表面供肝細(xì)胞黏附生長, 是后續(xù)細(xì)胞增殖生長、進(jìn)而組織化的關(guān)鍵。

     為了研究細(xì)胞培養(yǎng)方式對低溫保存后細(xì)胞功能的影響, 將大鼠肝細(xì)胞接種至兩種不同微載體(實體微載體Cytodex、多孔微載體Cytopore), 微重力高密度培養(yǎng)后于–80 °C凍存(凍存速率是1 °C/min, 5% DMSO+0.4 mol/L山梨糖醇)。2周后復(fù)溫細(xì)胞與載體材料, 用顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài), 計算細(xì)胞活力情況, 并通過細(xì)胞代謝功能指標(biāo)葡萄糖、白蛋白、尿素等的測定, 反映細(xì)胞在兩種載體培養(yǎng)和低溫保存后的生長和代謝情況。結(jié)果表明, 在細(xì)胞培養(yǎng)期間, Cytopore的MTT 值、代謝指標(biāo)值是Cytodex的1~1.5倍, 低溫保存后, Cytopore的各項指標(biāo)與低溫保存前差異不顯著, 而Cytodex的代謝指標(biāo)差異顯著。因此, 大鼠肝細(xì)胞在微載體Cytopore的高密度培養(yǎng)及低溫保存比 Cytodex更有利于細(xì)胞的生長和代謝。