免疫組化：

        融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和組織學(xué)技術(shù)（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，來(lái)對(duì)組織（細(xì)胞）內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究(主要是定位)。樣本是細(xì)胞或組織，稱(chēng)為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。要在顯微鏡下觀察結(jié)果，可能出現(xiàn)膜陽(yáng)性、質(zhì)陽(yáng)性和核陽(yáng)性。

免疫印跡（immunoblotting）又稱(chēng)蛋白質(zhì)印跡（Western blotting），

       是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。先要進(jìn)行SDS-PAGE，然后將分離開(kāi)的蛋白質(zhì)樣品用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用抗原-抗體-標(biāo)記物顯色來(lái)檢測(cè)樣品，可以用于定性和半定量。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，可以同時(shí)比較多個(gè)樣品同種蛋白的表達(dá)量差異。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

免疫組化 IHC / IF / ICC ——蛋白定位檢測(cè)分析首選

定位較直接準(zhǔn)確

定性靈敏度高

半定量（高質(zhì)量染色，背景淺，特異性強(qiáng)的切片；表達(dá)量較多的蛋白）

免疫印跡試驗(yàn) Western blot

測(cè)樣品內(nèi)蛋白含量，定量較IHC更準(zhǔn)確

定性和間接定位，敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)

二：免疫組化、免疫印跡對(duì)比——實(shí)驗(yàn)（抗體）準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備-抗體

品牌選擇：文獻(xiàn)出處(biorbyt目前有1000個(gè)一抗在外文文獻(xiàn)中引用)，試用裝預(yù)實(shí)驗(yàn)

        biorbyt可以提供各種研究領(lǐng)域159052種不同貨號(hào)的一抗，包括單抗/多抗，直標(biāo)抗體，磷酸化抗體，病毒抗體；各種標(biāo)記的二抗

biorbyt目前有1000多個(gè)抗體產(chǎn)品已在外文文獻(xiàn)中引用

 以CD133 antibody orb99113為例

一抗:    

－－-抗體名稱(chēng)（蛋白全名，uniprot ID）

－－-實(shí)驗(yàn)類(lèi)型（IHC, WB, FACS,ELISA）

－－-來(lái)源/種屬（rabbit，mouse，rat, human, goat等）

－－-react with （human, mouse, rat, chicken,sheep, cow, pig,  guinea pig等）

－－-單抗（特異性高，親和力弱，靈敏度低），多抗（特異性低，親和力強(qiáng)，靈敏度高）

－－-分析樣本中目的蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)（待測(cè)樣本蛋白結(jié)構(gòu)域，樣品處理過(guò)程影響）

二抗               

－－-根據(jù)一抗種屬來(lái)源而決定二抗來(lái)源

－－-標(biāo)記物的選擇。有HRP, Biotin, FITC,CY3, CY5, PE

直標(biāo)一抗      

－－-適用于直接免疫實(shí)驗(yàn)（組化，熒光，流式，WB）特異性高，避免非特異染色，快速方便，敏感度低

－－-親和性好的抗體才能進(jìn)行抗體標(biāo)記

抗體穩(wěn)定性

－－純度，高純度，保障其的穩(wěn)定性

－－濃度，高濃度減少容器表面吸附造成的物質(zhì)損失，穩(wěn)定性更好

抗體保存

－－避免反復(fù)凍融，分裝保存在-20℃

－－復(fù)融抗體：如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來(lái)

－－抗體工作液：應(yīng)該當(dāng)天配制當(dāng)天用完，4℃保存盡量不要超過(guò)1天

－－大部分抗體收到后4℃短暫保存1~2周對(duì)抗體活性沒(méi)有影響

－－運(yùn)輸條件：一般的運(yùn)輸過(guò)程需要1~2周的時(shí)間，在低溫4℃的條件下來(lái)完成的
  三：免疫組化、免疫印跡對(duì)比——實(shí)驗(yàn)（樣本）準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備-免疫組化實(shí)驗(yàn)樣本

 （新鮮，固定方式，充分脫水，防脫處理）

1.取材新鮮，及時(shí)固定：防止離體太久而發(fā)生組織自溶長(zhǎng)菌，抗原擴(kuò)散或丟失，易保存

2.固定液： 

（1）醛類(lèi)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，穿透性強(qiáng)，組織收縮少；醛基與蛋白氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇不能充分暴露，需要抗原修復(fù)

- 4%多聚甲醛（常用，適用大多數(shù)組織，細(xì)胞）

- 10%福爾馬林/甲醛（常用，脂肪類(lèi)，脊髓類(lèi)）

-戊二醛（微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好，用于電鏡）

（2）醇類(lèi)：穿透性強(qiáng)，脫水性強(qiáng)，易引起組織收縮，使蛋白變性作用輕，抗原可流失。

-乙醇，甲醇

（3）其他固定劑

-丙酮，抗原保存性好，脫色性更強(qiáng)，常用于部分細(xì)胞爬片

-混合固定劑，Bouni 液，Zamboni液，AAF液等

固定時(shí)間：醛類(lèi)建議24小時(shí)以內(nèi)，醇類(lèi)，丙酮2小時(shí)以內(nèi)，組織大小厚度略有差異

3. 充分脫水：保存時(shí)間長(zhǎng)，防止裂片，保持組織結(jié)構(gòu)，防止冰切形成冰晶

4. 防脫處理：防止掉片，多聚賴(lài)氨酸防脫切片，明膠和硫酸鉻鉀處理等

免疫組化切片類(lèi)型

1.石蠟切片

易保存（干燥低溫4~8℃保存），厚度3~6um，結(jié)構(gòu)形態(tài)好，需要抗原修復(fù)，抗原活性偏低（烤片，固定等）

2.冰凍切片

不易保存（-80℃保存半年），厚度10~20um，形態(tài)結(jié)構(gòu)較差，抗原活性高，不一定抗原修復(fù)，胞內(nèi)核內(nèi)抗原需打孔

冰凍切片是否需要抗原修復(fù)？如何固定？

（1）不能及時(shí)切片染色觀察：可選擇固定（24小時(shí)內(nèi)）后切片，需要修復(fù)；或馬上包埋切片后固定（10 min以內(nèi)），可修復(fù)可不修復(fù)

（2）馬上切片染色觀察的，可不固定，可不修復(fù)

3.細(xì)胞爬片（貼壁，半貼壁，懸�。�

單層細(xì)胞，均勻爬片，選擇合適的固定方式保證細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞周期同一化，不需要修復(fù)

－－-培養(yǎng)皿/平板                               －－-蓋玻片爬片

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備-WB實(shí)驗(yàn)樣本

新鮮制備，低溫 裂解 （全蛋白，不包括核抽提、亞細(xì)胞器分離等）

裂解液，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑

研磨（組織），液氮（小體積組織），超聲波（細(xì)菌/細(xì)胞）

跑膠，蛋白定量

Notice：

防止蛋白降解，磷酸化蛋白防止去磷酸化

濃度低蛋白量少不易檢測(cè)，濃度高裂解液粘稠不易吸取

分泌型蛋白，無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)收集上清，TCA沉淀富集

四：免疫組化、免疫印跡對(duì)比——實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)方案-免疫組化 IHC-P

脫蠟和水化，時(shí)間由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定

抗原修復(fù)，修復(fù)強(qiáng)度：高壓修復(fù)>微波修復(fù)>胰酶修復(fù)；修復(fù)液多種，EDTA>檸檬酸；85~95℃處理約15min，自然冷卻至室溫

細(xì)胞通透，TritonX-100, >10 um厚切片

滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素，3% H2O2 10~12min

血清封閉，小牛血清、BSA、羊血清, 不能與一抗來(lái)源一致

抗體孵育，濃度*重要，溫度決定反應(yīng)速度，時(shí)間決定反應(yīng)量

－－- 4℃過(guò)夜（16~24h），次日37 ℃復(fù)溫 30 min，反應(yīng)溫和，背景淺

－－- 37 ℃ （1-2 h），反應(yīng)速度快，時(shí)間短

－－- 室溫，無(wú)法保證每次環(huán)境溫度控制在一定范圍，不建議

抗體稀釋液（PBS, 專(zhuān)用的, PH7.4）

切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗，普通5 min*3 ，抗體10min*4）

DAB顯色，由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，決定背景的深淺和特異性染色的深淺

復(fù)染，目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，胞漿蛋白適當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，核蛋白則要短。

長(zhǎng)期保存，高倍鏡觀察，需脫水透化

封片，中性樹(shù)膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡

免疫熒光注意避光，防止熒光衰減淬滅，防止自發(fā)熒光現(xiàn)象

雙標(biāo)免疫熒光實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2個(gè)間標(biāo)抗體，需要不同host，不同的熒光標(biāo)記物

2個(gè)直標(biāo)抗體，可以同host，不同的熒光標(biāo)記物

1個(gè)間標(biāo)抗體+1個(gè)直標(biāo)抗體，不同host，不同熒光標(biāo)記物，兩抗體可共同孵育

1個(gè)間標(biāo)抗體+1個(gè)直標(biāo)抗體，同host，不同熒光標(biāo)記物，需先孵育間標(biāo)+二抗，后再孵育直標(biāo)

實(shí)驗(yàn)方案-Western blot

  跑膠，分離膠濃度，轉(zhuǎn)膜條件

  膜的選擇  0.45/0.22

  －－- NC，操作簡(jiǎn)單，強(qiáng)結(jié)合力，背景低，信噪比高，脆易卷，經(jīng)不起多度洗滌，適用多種顯色

 －－-PVDF，蛋白截留力（強(qiáng)6倍）、機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)耐受性更強(qiáng)，不適用熒光，預(yù)處理

  監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)膜

  封閉，5%脫脂奶粉/血清封閉（4℃過(guò)夜，或37℃ 搖床1~2 hour）

  抗體孵育（4℃過(guò)夜，或37℃ 搖床 1~2 hour）

  抗體稀釋液

  洗膜 （3~4次，7~10min/次）

  曝光

免疫組化結(jié)果常見(jiàn)問(wèn)題分析

結(jié)果陰性的原因

1. 抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤； 

2. 抗原修復(fù)不全，換修復(fù)液或加強(qiáng)修復(fù)；

3. 組織切片本身這種抗原含量低，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照片；

4. 血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；DAB 孵育時(shí)間過(guò)短；

6. 細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

非特異性染色的原因（著色一片黃/背景深）

1. 抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，抗體濃度；

2. 多抗易出現(xiàn)非特異性，可選擇單抗；

3. 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素滅活不夠；

4. 非特異性組分與抗體結(jié)合，延長(zhǎng)血清封閉時(shí)間；

5. DAB 孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高；

6. PBS 沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色；

7. 標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片；

8. 脫蠟不充分；

9. 二抗與標(biāo)本的內(nèi)源性組織蛋白有交叉反應(yīng)。

染色弱陽(yáng)性

1. 固定方式不當(dāng)或固定時(shí)溫度過(guò)高，影響到抗原的數(shù)量和質(zhì)量；

2. 不適當(dāng)?shù)目乖�修�?fù)方式，抗原決定簇暴露不足；

3. 抗體的稀釋度是否過(guò)高或者孵育的溫度/時(shí)間不足；

4. 孵育抗體前切片上遺留了過(guò)多的沖洗液；

5. 孵育時(shí)切片未放置水平，導(dǎo)致抗體孵育不均勻。

信號(hào)定位與預(yù)測(cè)不符的原因

1. 組織固定不及時(shí)，抗原擴(kuò)散移位；

2. 抗體選擇錯(cuò)誤；
3. 膜蛋白核質(zhì)染色：抗原修復(fù)過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，膜蛋白轉(zhuǎn)移。

WB結(jié)果常見(jiàn)問(wèn)題分析

1. 無(wú)條帶：抗體用錯(cuò)，轉(zhuǎn)膜出錯(cuò)，抗原無(wú)表達(dá)，試劑失效等；

2. 細(xì)微弱帶：上樣量少，抗體濃度低，ECL發(fā)光液失效等；

3. 高背景：封閉不夠，一抗?jié)舛雀撸�洗膜不充分�?/span>

4. 非特異性條帶：抗體特異性差，也可能樣品量大，抗體濃度高；

5. 條帶出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈：轉(zhuǎn)膜時(shí)膜和膠之間有氣泡；

6. 條帶中間出現(xiàn)白色：高濃度HRP把底物消耗過(guò)快后不發(fā)光；

7. 膜上很多黑點(diǎn)：膜上雜質(zhì)與抗體非特異結(jié)合，洗膜充分，封閉液混勻；

8. 條帶拖尾：蛋白裂解不好，蛋白量大，抗體孵育時(shí)間長(zhǎng)，濃度高等；

9. 出現(xiàn)非均一性背景：洗抗體和發(fā)光時(shí)膜出現(xiàn)風(fēng)干情況；

10. 條帶彎曲不平整：膠配置不均勻，膠中有氣泡雜質(zhì)，玻璃板沒(méi)洗干凈，電流不均一等；

11. 條帶蛋白分子量偏高/偏低：分離膠濃度選擇不恰當(dāng)，蛋白質(zhì)降解；

12. 所有條帶練成片：上樣量大或電泳中途停止過(guò)長(zhǎng)，樣品彌散。

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