本實驗在參考前人研究的基礎(chǔ)上，對提取方法、線性范圍、方法適用性等方面進(jìn)行研究，結(jié)合實際樣品的測定，建立一種穩(wěn)定、靈敏度高、適應(yīng)性好的蜂王漿中羥甲基糠醛含量的測定方法。
1 材料與方法
※分析檢測食品科學(xué)2008, Vol. 29, No. 03 413
1.1 儀器與試劑
高效液相色譜儀；固相萃小柱ENVI-C18（500mg，6ml）；固相萃取裝置；Turbo Vap LV 氮氣吹干儀；離心機(jī)。羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品（97.0%）；磷酸（優(yōu)級純） ；甲醇（色譜純） ；乙酸鋅溶液（150g/L）；亞鐵氰化鉀溶液（300g/L）；10% 的甲醇水溶液（10ml 甲醇與90ml水混合）；實驗用水為超純水。
標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水
配制成0.5mg/ml 的儲備液。分析前用流動相配制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.2 樣品處理
稱取5g 試樣，精確到0.001g，置于50ml 容量瓶中，加入30ml 水振蕩溶解。待樣品溶解后，分別加入3ml 乙酸鋅溶液和3 m l 亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白，用水定容至刻度，混勻，靜置1 0 m i n 。將溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，在5 0 0 0 r / m i n 離心1 0 min，取上清液，待凈化。將E N V I - C 1 8 萃取柱固定在萃取裝置上，分別加入5ml 甲醇、10ml 純水活化平衡，保持柱的濕潤。取15ml濾液到固相萃取柱中，上清液以不大于3ml/min 流速通過固相萃取柱，待液體完全流完后，用5 m l 1 0 % 甲醇水溶液清洗固相萃取小柱；真空減壓抽干后，用5 m l 甲
醇洗脫于1 0 m l 刻度試管中。將洗脫液用氮吹儀吹干后，用0.5ml 流動相溶解，樣液經(jīng)過0.45μm 的濾膜過濾后，上液相色譜儀測定。
1.3 液相色譜條件
色譜柱: C18（4.6mm × 250mm，5μm）；流動相：0 . 4 % 磷酸水溶液+ 甲醇（90+10）；流速0.8ml/min；檢測波長285nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量2 0μl。
2 結(jié)果與分析
2.1 提取方法的優(yōu)化
2.1.1 沉淀劑的選擇
常用的沉淀蜂王漿蛋白的試劑有無水乙醇溶液，磷酸溶液，鹽酸溶液，偏磷酸溶液，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液等，經(jīng)過實驗，這些溶液均能很好的將蜂王漿中的蛋白沉淀。但由于羥甲基糠醛對強(qiáng)酸，熱和氧化劑敏感，當(dāng)用磷酸、鹽酸、偏磷酸溶液時，羥甲基
糠醛的回收率很低，有可能在提取過程中，發(fā)生了分解。8 0 % 的乙醇水溶液對蜂王漿中羥甲基糠醛提取有很高的回收率，但在進(jìn)一步凈化前，需要用蒸發(fā)儀蒸干，而由于乙醇和水的混合液沸點很高，需要長時間的揮發(fā)，這不僅延長了測試樣品的時間，而且在揮發(fā)的過程中羥甲基糠醛很容易降解，因此本實驗選擇乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液作為沉淀劑。通過優(yōu)化實驗確認(rèn)，乙酸鋅溶液的濃度為150g/L；亞鐵氰化鉀溶液濃度為300g/L，各使用3 m l 就可以有效的將蜂王漿中蛋白沉淀，并獲得很好的提取回收率。
2.1.2 固相萃取小柱的選擇
對比了BAKERBOND SPETM C18（500mg/6ml）；ODS（C18）PHASE（500mg/6ml）；ACCUBOND ODS（C18）（500mg/6ml）；Oasis HLB（500mg/6ml）小柱和ENVI-C18（500mg/6ml）五種反相固相萃取柱對蜂王漿樣品的凈化效果。實驗表明，五種固相萃取柱差異較大，EN V I - C 1 8 小柱的回收率最高（90% 以上），Oasis HLB 和BAKERBOND SPETM C18的回收率在7 5 %～8 5 %，O D S （ C 1 8） P H A S E 和A C C U B O N DO D S （ C 1 8 ）柱的回收率在6 0 %～8 0 %。因此，本方法選擇E N V I - C 1 8 固相萃取柱為凈化柱。
2.2 液相色譜柱的選擇
分別選用Symmetry C18 （4.6mm × 250mm，5μm），Diamonsil C18 （4.6mm × 250mm，5μm），Waters Nova-Pak C18 （3.9mm × 150mm，5μm），μBondapak C18 （4.0mm× 3 0 0 m m，1 0μm ）四種色譜柱對蜂王漿中羥甲基糠醛進(jìn)行了色譜條件的實驗。實驗發(fā)現(xiàn)，這四種色譜柱都可以用于對羥甲基糠醛含量的分析，只有保留時間和靈敏度有所不同，Symmetry C18 柱靈敏度和峰型均很好，所以我們選用Symmetry C18 （4.6mm × 250mm，5μm）色譜柱進(jìn)行羥甲基糠醛的測定。標(biāo)準(zhǔn)圖譜與實際樣品分離圖譜
見圖1 。
2.3 線性關(guān)系和檢出限
用羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液分別配制濃度為0 . 1 0、0.20、1.0、2.0、5.0、20.0mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜條件下進(jìn)行測定，進(jìn)樣量2 0μl ，用峰高與標(biāo)準(zhǔn)濃度作圖，線性方程為Y=2.3772X+0.024，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。當(dāng)檢測0.10mg/L 標(biāo)準(zhǔn)濃度時，所測譜圖的信噪比大于1 0 。根據(jù)最終樣液所代表的試樣量、定容體積和進(jìn)樣量計算，確定本方法檢出限為0 . 2 m g / k g。
2.4 回收率和精密度
在樣品上做0.2、1、5、10mg/kg 四個添加水平的加標(biāo)回收率實驗，每個濃度重復(fù)四次，測定的平均回收率及精密度見表1。在0.2～10mg/kg 添加濃度范圍內(nèi)，回收率在87.2%～93.1% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.4%，能夠滿足蜂王漿中羥甲基糠醛含量的常規(guī)分析。
2.5 實際樣品的測定
添加濃度 （mg/kg） 0.2 1 5 10
回收率Intra-daya 89.4±3.4 89.2±2.1 92.2±2.3 93.1±1.1
（%, X ± SD） Inter-dayb 87.2±3.1 91.7±3.2 91.2±2.7 92.3±2.5
表 1 蜂王漿中羥甲基糠醛的添加回收率
Table 1 Recoveries of hydroxymethylfurfural in royal jelly
注：Intra-daya 為日內(nèi)添加回收率，測定4次；Inter-dayb 為日間添加回
收率，測定4 次。
414 2008, Vol. 29, No. 03 食品科學(xué)※分析檢測
隨機(jī)從市場上購買的蜂王漿樣品1 4 個，采用本實驗建立的高效液相色譜方法對樣品進(jìn)行分析，實際測定
結(jié)果見表2 。
結(jié)果表明，大多數(shù)樣品中都檢出了羥甲基糠醛，檢出樣品中羥甲基糠醛的含量在0.9～26.4mg/kg 之間。
羥甲基糠醛有可能能成為評價蜂王漿質(zhì)量和貯存效果的指標(biāo)之一。
3 結(jié) 論
蜂王漿樣品基質(zhì)復(fù)雜，富含蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)。本實驗采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉降蛋白，結(jié)合固相萃取方法，有效地降低了基質(zhì)干擾。方法回收率在87.2%～93.1% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～3.4%，該方法具有方便、準(zhǔn)確、靈敏度高、精密度好等優(yōu)點，是一種測定蜂王漿中羥甲基糠醛的有效方法。