1.適用范圍

本方法適用于出口茶葉中黃曲霉毒素B₁含量的檢驗(yàn)。

2.原理概要

樣品用三氯甲烷提取，提取液經(jīng)硅膠柱凈化，凈化后的提取液用三氟乙酸衍生，用配有熒光檢測(cè)器的液相色譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。

3.主要試劑和儀器

3.1.主要試劑

三氯甲烷；

正己烷；

苯；

甲醇：紫外光譜級(jí)；

乙腈：紫外光譜級(jí)；

三氟乙酸；

乙腈-水溶液（1＋1）；

三氯甲烷-甲醇溶液（95＋5）；

苯-乙腈溶液（98＋2）；

黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%；

黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量的黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)品，以苯-乙腈溶液于棕色容量瓶中，配成濃度為10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液。根據(jù)需要，再配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

3.2.儀器

液相色譜儀，配有熒光檢測(cè)器；

硅膠小柱：Waters Sep-pak Silica前處理小柱或相當(dāng)?shù)墓枘z前處理小柱；

振蕩器；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，配有100mL具尾管的圓底燒瓶；

微量注射器；

離心管：5mL具塞磨口；

粉碎機(jī)；

濾膜：有機(jī)系用，0.45μm；

微孔濾膜過濾器：有機(jī)系用，0.5μm。

4.試樣的抽取與制備

4.1.檢驗(yàn)批

以不超過2000件為一檢驗(yàn)批。

同一檢驗(yàn)批的商品應(yīng)具有相同的特征，如包裝、標(biāo)記、產(chǎn)地、規(guī)格、等級(jí)等。

4.2.抽樣數(shù)量

4.3.抽樣方法

從整批產(chǎn)品堆垛的上下不同部位隨機(jī)抽取2.2規(guī)定的件數(shù)，逐件開啟。分別倒出全部茶葉于塑料布上，用取樣鏟從每件中各取出有代表性的樣品約500g。將所取樣品充分混勻，用四分法或分樣器逐步縮分出500g，裝入潔凈密封的樣品筒內(nèi)，加封后，標(biāo)明標(biāo)記，及時(shí)送實(shí)驗(yàn)室。

4.4.試樣制備

將所取回樣品全部磨碎，通過20目篩，混勻，均分成兩份試樣，裝入潔凈容器內(nèi)，密封，標(biāo)明標(biāo)記。

4.5.試樣保存

將試樣于室溫下保存。

注：在抽樣和制樣的操作過程中，必須防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。

5.過程簡述

5.1.提取

稱取試樣5.0g（精確到0.1g）置于100mL具塞錐形燒瓶中，加入15mL三氯甲烷，于振蕩器上提取30min，然后經(jīng)墊有玻璃纖維的漏斗過濾。收集濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的具尾管圓底燒瓶內(nèi)，并用三氯甲烷洗滌濾渣，收集濾液至約20mL。

5.2.凈化

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上述濾液在50℃水浴中濃縮至約1mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，注入硅膠小柱中。用2～4mL正己烷洗滌燒瓶后淋洗小柱，棄去流出液。然后用3～4mL三氯甲烷-甲醇溶液以每秒鐘2滴的流速洗脫，收集洗脫液于離心管中。用氮?dú)饩従彺蹈�，供衍生用�?/span>

5.3.衍生

5.3.1.試樣

加200μL正己烷和50μL三氟乙酸于上述離心管中，蓋緊磨口塞，超聲振蕩1min，靜置10min，打開磨口塞，緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)庵粮�。用乙�?span lang="EN-US">-水溶液（1＋1）定容至1.0mL，超聲1min，用0.5μm濾膜過濾，濾液供液相色譜用。

5.3.2.標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

取1.0mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用氮?dú)饩従彺蹈桑��?span lang="EN-US">5.3.1步驟操作。

5.4.測(cè)定

5.4.1.色譜條件

色譜柱：NOVA PAKc₁₈，300mm×3.9mm（內(nèi)徑）；

流動(dòng)相：甲醇-水溶液（42＋58）；

流速：0.8mL/min；

熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長425 nm；

色譜柱溫度：室溫。

5.4.2.測(cè)定

根據(jù)樣液中黃曲霉毒素B₁的含量情況，選定峰高相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中黃曲霉毒素B₁衍生物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)線性范圍

內(nèi)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液的衍生物溶液等體積參插進(jìn)樣測(cè)定。在上述色譜條件下，黃曲霉毒素B₁衍生物保留時(shí)間約為8min。

5.4.3.空白試驗(yàn)

除不加試樣外，按上述測(cè)定步驟進(jìn)行。

6.結(jié)果計(jì)算

用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按下式計(jì)算試樣中黃曲霉毒素B₁的含量：

式中：X —— 試樣中黃曲霉毒素B₁的含量，mg/kg；

A —— 樣液中黃曲霉毒素B₁衍生物的峰面積，mm²；

c_s —— 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中黃曲霉毒素B₁的濃度，μg/mL；

A_s —— 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中黃曲霉毒素B₁衍生物的峰面積，mm²；

c —— 最終樣液所代表試樣的濃度，g/mL。

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。

7.低限和回收率測(cè)定

7.1.低限

本方法的測(cè)定低限為0.001mg/kg。

7.2.回收率

回收率的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：黃曲霉毒素B₁的添加濃度在0.001～0.5mg/kg范圍內(nèi)，回收率為89.1%～104.9%。