一、實驗試劑

1、培養(yǎng)基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、檢測試劑：肌動蛋白、a-SMA或Desmin抗體，熒光標記二抗，4%多聚甲醛

二、實驗器械

1、培養(yǎng)皿
2、培養(yǎng)瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科鑷和止血鉗
5、玻璃滴管
6、燒杯
7、15ml離心管


三、實驗流程

成年大鼠，麻醉，無菌獲取主動脈血管
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1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌血管，剝?nèi)パ�管外膜外附著的組織
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縱向剪開血管，內(nèi)膜向上，用鈍鑷子橫向刮動血管內(nèi)膜，去掉內(nèi)皮細胞，用1 × PBS （pH 7.4 ）反復洗滌。
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用鑷子橫向刮動血管，刮下來中膜層，收集中膜用PBS洗滌，加入少量培養(yǎng)基（PriCells），將血管剪切為1×1mm3的小塊，1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次
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組織塊中加入消化液（PriCells），轉(zhuǎn)至15ml離心管中于37℃水浴恒溫消化15min，間隔2-3min搖動，靜置1min，收集消化液，重復消化3-4次。
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收集消化液，加入消化終止液（PriCells）終止反應
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離心，1000rmp,10min，棄去上清
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重懸，計數(shù)細胞
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接種密度以5 × 105個/ml
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培養(yǎng)37℃，5%CO2

四、實驗操作

1、培養(yǎng)瓶預包被。試驗前一天預包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。

2、取材：正常成年大鼠腹腔注射5%苯巴比妥麻醉，75%酒精浸泡，無菌條件下迅速取出大鼠主動脈。

3、材料預處理：將獲取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反復洗滌，去除血管外部的血漬，洗滌液澄清，用無菌鑷子剝?nèi)ネ饽っ娴臍埩艚M織。PBS洗滌凈。

4、除去內(nèi)皮細胞：將血管縱向剪開， 內(nèi)膜面向上，無菌鑷子沿中軸方向反復刮動內(nèi)膜層4-5遍，去掉內(nèi)皮細胞，用1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次。

5、分離中膜：將去掉內(nèi)膜的血管，繼續(xù)刮動分離中膜，去掉外膜，用眼科剪將內(nèi)膜剪碎為1×1mm3的小塊，加入1 × PBS （pH 7.4 ），轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中，PBS洗滌3次，離心收集沉淀物。

6、消化：在洗凈的內(nèi)膜碎塊中加入消化酶液，將離心管放入37℃水浴消化15min。

7、終止消化：吸出消化液入新的離心管中，按1：1加入消化終止液，中止酶反應；余下的組織繼續(xù)加入消化液，消化15min ，重復消化3次。

8、收集重懸細胞：收集中止后的消化液于離心管中，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸，染色計數(shù)細胞。

9、培養(yǎng)細胞密度：調(diào)整細胞密度以5 × 105個/ml 接種入培養(yǎng)瓶。

10、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。

五、細胞鑒定

1、顯微鑒定：相差顯微鏡下，可見細胞呈長梭狀，具備良好的透光性。細胞之間呈現(xiàn)典型的波峰波谷樣生長，有接觸抑制的特點。

2、免疫組織化學鑒定 ：利用肌動蛋白、a-SMA或Desmin免疫熒光染色鑒別平滑肌細胞。
1） 細胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，接種細胞為3×104個/孔，48小時候細胞可以長滿，用鑷子取出鋪滿細胞的蓋玻片備用。
2） 細胞固定：用1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌細胞，之后放入4%多聚甲醛中，固定10min，空氣中自然干燥。
3） 特異性抗體：按照說明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37℃孵育60min。
4） 洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
5） 標記性抗體：加入熒光標記抗體，37℃孵育30min。
6） 洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
7） 封片：封片劑封片。
8） 鏡檢：熒光顯微鏡下觀察，平滑肌細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)較強棕紅色熒光。

六、注意事項

1、為了保持細胞活力，大鼠適宜采用藥物麻醉后取材。大鼠應嚴格消毒，無菌解剖，打開胸腔后換取另一套器械獲取主動脈血管。

2、注意盡可能洗滌凈血管內(nèi)的殘血，避免血細胞及某些血清成分對細胞貼壁的影響。

3、血管由內(nèi)膜層，中膜層和外膜層三層膜結(jié)構(gòu)構(gòu)成，而血管平滑肌細胞主要分布在血管中膜層，采用機械刮除法去掉內(nèi)膜后再獲取中膜以分離細胞，從血管內(nèi)膜面刮下的細胞可以收集計數(shù)，培養(yǎng)主動脈血管內(nèi)皮細胞。

4、酶消化法分離血管平滑肌細胞，酶消化過度容易損傷細胞，影響平滑肌細胞的貼壁，因此消化過程中應針對所分離的細胞源組織的構(gòu)成，選擇適宜的酶，并嚴格掌握好酶的消化濃度和消化時間。

5、嚴格控制細胞培養(yǎng)條件。包括細胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基，生長因子，血清，抗生素）的質(zhì)量，濃度。

6、傳代培養(yǎng)細胞接種量為5×104個（25 cm2培養(yǎng)瓶），細胞倍增時間為48小時。細胞傳代培養(yǎng)最佳為5-8代， 傳代次數(shù)增加，細胞體積增大，細胞間易相互融合，界限不明朗，細胞貼壁牢固，傳代消化時間會有所延長。