免疫組化DAB法 顯示過氧化物酶

〔原理〕 過氧化物酶分解H2O2的過程中，下面反應(yīng)不直接發(fā)生：AH2（供氫體）+H2O2→A（供氫體的氧化物）+2H2O2實(shí)驗(yàn)可知，有稱為復(fù)合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氫體）復(fù)合體生成，在復(fù)合體最后分解為酶和水時，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學(xué)中所使用的供氫體應(yīng)是含有色原性基團(tuán)的發(fā)色物質(zhì)，如奈酚和聯(lián)苯胺。
免疫組化染色步驟（以ABC法為例）
溶液的配置：
1. 0.1M 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g, Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份
2. 檸檬酸鹽緩沖液：
貯存液：0.1M檸檬酸溶液（A）：21.01g 檸檬酸 + 1L 蒸餾水
0.1M檸檬酸三鈉溶液（B）：29.41g 檸檬酸三鈉 + 1L 蒸餾水
工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸餾水→0.01M檸檬酸鹽緩沖液
3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 純甲醇→充分混勻
4. 20% 甘油：80ml 純甘油 + 320ml 蒸餾水
5. 稀釋抗體：1︰300 ，1︰400 ，1︰600 （臨用前配）
6. 酒精的配置
染色步驟：一步法
1. 載玻片 烤箱中 60℃ 40′。
2. 二甲苯Ⅰ，60℃ 20′（水浴箱中），二甲苯Ⅱ，室溫 15′。
3. 脫水，100%→95%→85%→75%酒精，每級均為3′。
4. 蒸餾水沖洗， 5′﹡1
5. 微波爐修復(fù)抗原：0.01M 檸檬酸鹽緩沖液，99℃ 肺 20′，心腎 12′
6. 3′*3
7. 0.03% H2O2-甲醇，室溫20′
8. 沖洗， 3′*3，甩干或紙巾吸去多余液體（勿碰到組織），PAP Pen劃境線。
9. block solution 封閉抗原，室溫10′。
10. 傾出封閉液，不洗，滴加一抗（60ul），4℃過夜或37℃ 1～2h。
11. 沖洗，3′*3。
12. 除去，滴加A增強(qiáng)劑，室溫25′。
13. 沖洗，3′*3。
14. 除去，滴加B劑，室溫35′。
15. 沖洗，3′*3。同時配置DAB顯色劑。
16. 除去，DAB顯色10′（在顯微鏡下觀察染色程度控制染色時間）。蒸餾水沖洗。
17. 復(fù)染：蘇目素均勻滴加2滴，40′′，蒸餾水沖洗，60℃溫水泡半分鐘。
18. 脫水：75%酒精→85%→95%→100%（3次），每級3′。
19. 透明：二甲苯Ⅰ3′，二甲苯Ⅱ3′。
18. 封片：中性樹脂，加蓋玻片（組織部位切勿殘留小氣泡），60℃ 0.5h烘干。
結(jié)果：棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物代表抗原X的定位。
拍照
1. 更換樣品時，除了調(diào)整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動！所有的樣品必須一次拍攝完全。特別是在拍攝過程中，不要一會用高倍鏡，一會用低倍鏡，來回切換物鏡。
2. 數(shù)碼相機(jī)必須設(shè)置為手動曝光，并且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時間，同樣的光圈。特別要注意的是，一定要將數(shù)碼相機(jī)的自動白平衡功能給關(guān)掉
3. 免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色。測量其灰度應(yīng)在250左右。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機(jī)自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍(lán)。