T-2毒素快速檢測試劑

酶聯(lián)免疫分析快速定量測定T-2毒素試劑盒 （產(chǎn)品編號：R5302） 德國R-Biopharm制造 （中文翻譯件僅供參考,以試劑盒內(nèi)附的英文原件為準(zhǔn)）

1.用途

    采用競爭性的酶免疫分析法定量分析谷物及飼料中的T-2毒素。試劑盒中含有酶免疫分析法所用的所有的試劑。試劑盒可以進(jìn)行48個(gè)試驗(yàn)，包括標(biāo)準(zhǔn)。定量分析要求使用酶標(biāo)板讀數(shù)儀。

2.概要

     T-2毒素是由幾種鐮刀素菌屬產(chǎn)生的，是人類營養(yǎng)中毒的白細(xì)胞缺乏癥疾病的主要起因毒素,它對許多動(dòng)物也有不力影響，由于T-2 毒素的毒性對于蛋白質(zhì)合成的損害是很明顯的。

    對禽類的研究表明 T-2毒素導(dǎo)致體重增長速度減慢及其他問題，如禽類嘴夾的損害，羽毛雜亂，控制肌肉生長的神經(jīng)中樞損傷并且易受到沙門氏菌的感染。

    在許多其他動(dòng)物中，一直有報(bào)到產(chǎn)生腸蠕動(dòng)，嘔吐 和改變線粒體。T-2毒素的存在伴隨出現(xiàn)細(xì)胞和器官損壞的大面積的蔓延，包括：血液，肝臟，腎臟，胰腺肌肉及心臟的影響。T-2毒素引起的消化系統(tǒng)的損壞是不可逆轉(zhuǎn)的。

    除了人類以外，動(dòng)物也會受到T-2毒素的影響包括豬，乳牛，家禽，狗和馬。在嚴(yán)重的情況下T-2 毒素可以引起死亡。

HPLC,TLC 及GC是檢測T-2毒素常用的方法,但是這些方法制備樣品費(fèi)時(shí)又費(fèi)力并且需要昂貴的儀器設(shè)備及很專業(yè)的技術(shù)培訓(xùn)，而使用RIDASCREEN FASTT-2毒素快速檢測試劑盒則能夠給你提供快速而準(zhǔn)確的分析.

3． 測定原理

測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有針對兔IgG的羊抗體。加入T-2 毒素抗體，酶標(biāo)記物，標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。游離T-2 毒素素與酶標(biāo)記物競爭T-2 毒素抗體，同時(shí)T-2 毒素抗體與羊抗體連接。沒有連接的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)（過氧化尿素）和發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測量，吸收光強(qiáng)度與樣品中的濃度成反比。

4． 提供的試劑

每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行43個(gè)測量（附加5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分析孔），盒中的材料如下：

1 X 48孔板（6條 X  8孔，可以拆分為單孔）包被有羊抗體

5 X 標(biāo)準(zhǔn)液, 1ml/瓶, 為T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)液濃度為：0ppb;  50ppb;  100ppb ;  200ppb;  400ppb

1 X  T-2 毒素抗體溶液（3ml）鼠單克隆，直接使用，黑色帽

1 X  酶標(biāo)記的T-2 毒素，直接應(yīng)用液（3ml）…….紅色帽

1 X  基質(zhì)/發(fā)色劑（6ml）……………………….…..白色滴瓶

1 X  反應(yīng)停止液1M硫酸（6ml）...….……….…..黃色滴瓶

5． 需要的材料但盒中不提供

－－－－5.1設(shè)備

－－－－微孔板酶標(biāo)儀（450nm）定量分析用

－－－－振蕩器

－－－－粉碎機(jī)

－－－－50ul, 100ul, 1000ul微量加樣器

－－－－100ml量筒

－－－－50ml 漏斗及容量瓶

－－－－WhatmanＮｏ１或相當(dāng)?shù)臑V紙

5.2 試劑

－－－－甲醇，７０％甲醇溶液，蒸餾或去離子水。

6. 操作者應(yīng)該注意之事項(xiàng)

－－－－標(biāo)準(zhǔn)液含有T-2 毒素，應(yīng)特別小心

－－－－使用過的玻璃容器及T-2 毒素溶液最好用pH7的高

   氯酸溶液（10%V/V）浸泡過夜

－－－－反應(yīng)停止液為1M硫酸,避免接觸皮膚

－－－－不要使用過了有效日期的試劑盒, 稀釋或攙雜使用會引起 

   靈敏度的降低.

－－－－不要交換使用不同批號的盒中試劑.

7. 儲存條件

－－－－保存試劑盒于2-80C.不要冷凍

－－－－無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下

－－－－將不用的微孔板放進(jìn)原 錫箔袋中并且與提供的干燥劑

  一起重新密封.

8. 試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色試劑有任何顏色,表明發(fā)色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之. 0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.6個(gè)單位 （A450nm<0.6）時(shí),表示試劑可能變質(zhì).

9. 樣品處理 （樣品應(yīng)當(dāng)在暗處及冷藏保存）

－－－－5g粉碎的樣品與25ml甲醇70%溶液

－－－－振蕩3分鐘，

－－－－用Whatman No.1濾紙?zhí)崛?/font>

－－－－用1ml蒸流水稀釋1ml濾液

－－－－取50ul稀釋液進(jìn)行分析

*根據(jù)需要可以增加樣品量，但甲醇溶液的量也應(yīng)相應(yīng)增加。

10. 酶標(biāo)免疫分析程序

10.　1 　測定之前注意事項(xiàng)

1. 使用之前將所有試劑回升至室溫.（18-24oC）

2. 使用之后立即將所有試劑放回2-8 oC.

3. 在使用中不要讓微孔干燥

4. 在EIA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是EIA測定程序中的要點(diǎn).

5. 在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋子蓋住微孔板.

10．２　包被有抗體的微孔板條

錫箔袋沿橫向壓皺外邊打開.取出需用數(shù)量的微孔板及框架, 將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封, 保存于2-80C.不要冷凍.

10.3標(biāo)準(zhǔn)液

   T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)液為直接應(yīng)用液，已經(jīng)考慮了樣品制備的10倍稀釋，因此樣品中的T-2 毒素的濃度可以直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出。

10.4測定程序,在18-24 oC條件下操作

1. 將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架

2. 加入50ul的標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭。

3. 加入50ul酶標(biāo)記物到微孔底部, （紅色蓋）。（ 注意移液器管尖千萬不要接觸到放進(jìn)孔中的液體，避免交叉污染。）

4. 加入50ul抗體溶液（黑色蓋）到每一個(gè)微孔底部，充分混合，在室溫孵育10分鐘。（注意此操作步驟要快，盡量保持前后孔孵育時(shí)間的一致，如果實(shí)驗(yàn)所用孔數(shù)量多，請用多通道移液器。移液器管尖千萬不要接觸到放進(jìn)孔中的液體。）

5. 倒出孔中的液體,將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體.用洗瓶或多通道移液器將250ul蒸餾水加入孔中。再次倒出孔中的液體,完全除去孔中的液體，再重復(fù)操作洗滌步驟兩次以上。（移液器管尖千萬不要接觸到放進(jìn)孔中的液體，避免污染洗滌液造成洗板不徹底。洗板后要立即進(jìn)行下一步操作，避免板孔干躁造成重復(fù)性差）

6． 加入 2滴（或100ul）基質(zhì)/發(fā)色試劑（白色滴瓶）到微孔

中, 充分混合并在室溫  暗處孵育5分鐘。（注意此操作步驟要快，盡量保持前后孔孵育時(shí)間的一致，如果實(shí)驗(yàn)所用孔數(shù)量多，請將所需數(shù)量的滴瓶中液體轉(zhuǎn)移至V型試劑槽中注意避光，并用多通道移液器加液。移液器管尖千萬不要接觸到放進(jìn)孔中的液體。）

7． 加入 2滴（或100ul）反應(yīng)停止液（黃色滴瓶）到微孔中混合好, （注意此操作步驟要快，如果實(shí)驗(yàn)所用孔數(shù)量多，請將所需數(shù)量的滴瓶中液體轉(zhuǎn)移至V型試劑槽中，并用多通道移液器加液。）在450nm處測量吸光度值以空氣為空白,必須在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值.

11. 結(jié)果

定量分析：所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值再乘以100.因此0標(biāo)準(zhǔn)等于100%并且以百分比給出吸光度值.

標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值（或樣品）

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－x 100=   %吸光度值

0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值

計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成為一個(gè)對應(yīng)T-2 毒素濃度（ug/kg）的半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖, 相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度（ug/kg）可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出.

RIDASCREEN FAST T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線見英文原版說明書

儀器半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于（吸光度高）還是大于（吸光度低）標(biāo)準(zhǔn)值。

目測半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于（顏色深）還是大于（顏色淺）標(biāo)準(zhǔn)值。特別注意如果選擇50ppb 或100ppb 的標(biāo)準(zhǔn)，請?jiān)诓襟E6中將在室溫暗處孵育5分鐘 更改為2-3分鐘。

12．靈敏度

檢測下限小于20ppb，此時(shí)的吸光度值明顯不同于0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值。定量檢測下限為50ug/kg（50ppb）。

12．1 檢測限

檢測限為20ppb，（通過對不含T-2 毒素的谷物及混合飼料的多次重復(fù)測定，平均吸光度+3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢測下限，所有結(jié)果均在10-20ppb之間。）

12．2 定量檢測限

通過添加實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)定量檢測下限為50 ppb，此時(shí)的回收率為70%-110%，CV值小于20%

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