T-2毒素檢測(cè)試劑

酶聯(lián)免疫分析定量測(cè)定T-2毒素試劑盒。德國(guó)R-Biopharm制造 （中文翻譯件僅供參考，以試劑盒內(nèi)附的英文原件為準(zhǔn)）

RIDASCREEN T-2 Toxin （產(chǎn)品編號(hào)：R3801）

簡(jiǎn)介

競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫法定量測(cè)定谷物及飼料中的T-2毒素。試劑盒中包括了所有檢測(cè)用的試劑。該試劑盒有96個(gè)試驗(yàn)孔包括標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，如果進(jìn)行定量分析，必須有微孔板酶標(biāo)儀。

樣品提�。�………………………………………………甲醇提取

檢測(cè)時(shí)間：樣品處理（以檢測(cè)10個(gè)樣品為例）

谷物和飼料…………………………………約30min

檢測(cè)時(shí)間……………………………………約1.5h

檢測(cè)限：…………………………………………………< 5ppb

回收率：…………………………………………………約90%

交叉反應(yīng)：

1. 用途

RIDASCREEN T-2 Toxin競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫法定量測(cè)定谷物及飼料中的T-2毒素。

2. 概要

T-2毒素是由三線鐮刀菌產(chǎn)生的代謝物，也是自然界最早發(fā)現(xiàn)的單端孢霉烯族化合物毒素。T-2毒素經(jīng)常會(huì)在農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)，而且分布的范圍及產(chǎn)生的濃度范圍都很寬。T-2毒素會(huì)對(duì)人及動(dòng)物產(chǎn)生細(xì)胞毒性和免疫抑制作用。

目前，檢測(cè)飼料及食品中的T-2毒素主要是采用HPLC、DC 及GC三種檢測(cè)方法，但是這些方法制備樣品費(fèi)時(shí)又費(fèi)力并且需要昂貴的儀器設(shè)備及專(zhuān)業(yè)的技術(shù)培訓(xùn)，而使用RIDASCREEN T-2毒素檢測(cè)試劑盒則能夠給你提供快速而準(zhǔn)確的分析。

3. 測(cè)定原理

測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有針對(duì)兔IgG的羊抗體。加入T-2 毒素抗體，酶標(biāo)記物，標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。游

離的T-2 毒素與酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)T-2 毒素抗體，同時(shí)T-2 毒素抗體與羊抗體連接。沒(méi)有連接的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去，將酶基質(zhì)（過(guò)氧化尿素）和發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后，使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測(cè)量，吸收光強(qiáng)度與樣品中的濃度成反比。

4.  提供的試劑

每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行96個(gè)測(cè)量（包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔），盒中的材料如下

1× 96孔板（12條 ×  8孔）包被有抗兔IgG的羊抗體

6× 標(biāo)準(zhǔn)液，1.3ml/瓶，為T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)液濃度為：0ppb，0.1ppb，0.2ppb，0.4ppb，0.8ppb，1.6ppb

1×  T-2 毒素抗體溶液（5ml）鼠單克隆，直接使用…..黑色帽

1×  酶標(biāo)記的T-2 毒素，直接應(yīng)用液（5ml）...…….…紅色帽

1×  基質(zhì)（7ml）...….……….…………….………………綠色帽

1×  發(fā)色劑（7ml）...….……….…………………….…....藍(lán)色帽

1×  反應(yīng)終止液，1N硫酸（14ml）...….……………..….黃色帽

1×  樣品稀釋緩沖液（50ml）

5.  需要的材料但盒中不提供

5.1設(shè)備

－－－－酶標(biāo)儀（450nm）定量分析用

－－－－粉碎機(jī)

－－－－濾紙或是離心機(jī)

－－－－磁力攪拌器

－－－－50?l，100?l，500?l，1000?l微量移液器

5.2 試劑

－－－－甲醇

－－－－pH值為7.2的樣品稀釋用磷酸鹽緩沖液 （PBS緩沖液）： 0.55 g NaH2PO4 × H2O + 2.85 g Na2HPO4 × 2 H2O + 9 g NaCl；用蒸餾水定溶至 1000 ml

注：如果毒素含量較高，需要更高倍稀釋時(shí)（大于1：7），應(yīng)向此緩沖液中加入10%的甲醇溶液，以保證甲醇溶液的濃度為10%。（見(jiàn)9.1）

6. 操作者應(yīng)該注意之事項(xiàng)

－－－－標(biāo)準(zhǔn)液含有T-2 毒素，應(yīng)特別小心，避免接觸皮膚（試驗(yàn)時(shí)要戴手套）。

－－－－使用過(guò)的玻璃容器及T-2 毒素溶液最好用pH 7（用HCl調(diào)整）的次氯酸鈉溶液（10%（V/V））浸泡過(guò)夜

－－－－反應(yīng)終止液為1N硫酸，避免接觸皮膚

－－－－不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起   靈敏度的降低

－－－－不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑

7. 儲(chǔ)存條件

－－－－保存試劑盒于2-8℃。不要冷凍。

－－－－無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下

－－－－將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封

8. 試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。

0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.6個(gè)單位（A450nm<0.6）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)）

9. 樣品處理

樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存

有代表性的樣品應(yīng)當(dāng)按照官方公認(rèn)的方法進(jìn)行采樣及處理。

谷物和飼料

－－－－5g粉碎的樣品與25ml 70%的甲醇水溶液（70/30（V/V））

－－－－在磁力攪拌器上攪動(dòng)10分鐘

－－－－用濾紙過(guò)濾或是用離心機(jī)離心進(jìn)行提取

－－－－取50?l濾液或是懸浮液加入300?l樣品稀釋緩沖液（PBS緩沖液）[稀釋倍數(shù)1：7（1+6）] 

－－－－取50?l提取液進(jìn)行分析

根據(jù)需要可以增加樣品量，但甲醇溶液的量也應(yīng)相應(yīng)增加

例如：25g樣品加入125ml 70%的甲醇溶液或是50g樣品加入250ml 70%的甲醇水溶液。

注意：如果T-2毒素的濃度值大于56ppb,則需要對(duì)樣品進(jìn)一步稀釋。例如：取50?l提取液與450?l的磷酸鹽緩沖液（其中含有10%的甲醇溶液）混合。[稀釋倍數(shù)：1：10（1+9）]

10. 酶標(biāo)免疫分析程序

10.1測(cè)定之前注意事項(xiàng)

1.使用之前將所有試劑回升至室溫（20-25℃）。

2.使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3.在使用中不要讓微孔干燥。

4.在EIA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是EIA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。

5.在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板。

10.2包被有抗體的微孔板條

錫箔袋沿橫向壓皺外邊打開(kāi)。取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-80C。不要冷凍。

10.3測(cè)定程序  （在20-25℃條件下操作）

1. 將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架。

2. 加入50?l的標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭。

3. 加入50?l酶標(biāo)記物（紅色帽）到微孔底部。（注意移液器管尖千萬(wàn)不要接觸到放進(jìn)孔中的液體，避免交叉污染。）

4. 加入50?l抗體溶液（黑色帽）到每一個(gè)微孔底部，充分混合，在室溫孵育1小時(shí)。（注意此操作步驟要快，盡量保持前后孔孵育時(shí)間的一致，如實(shí)驗(yàn)果所用孔數(shù)量多，請(qǐng)用多通道移液器。移液器管尖千萬(wàn)不要接觸到放進(jìn)孔中的液體。）

5. 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。用洗瓶或多通道移液器將250?l蒸餾水加入孔中。再次倒出孔中的液體，完全除去孔中的液體，再重復(fù)操作洗滌步驟兩次以上。（移液器管尖千萬(wàn)不要接觸到放進(jìn)孔中的液體，避免污染洗滌液造成洗板不徹底。洗板后要立即進(jìn)行下一步操作，避免板孔干燥造成重復(fù)性差異）。

6. 加入50?l基質(zhì)（綠色帽）和50?l發(fā)色試劑（藍(lán)色帽）到微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育30分鐘。（注意此操作步驟要快，盡量保持前后孔孵育時(shí)間的一致，如果實(shí)驗(yàn)所用孔數(shù)量多，請(qǐng)將所需數(shù)量的滴瓶中液體轉(zhuǎn)移至V型試劑槽中注意避光，并用多通道移液器加液。移液器管尖千萬(wàn)不要接觸到放進(jìn)孔中的液體。）

7.  加入100?l反應(yīng)終止液（黃色蓋）到微孔中混合好，（注意此操作步驟要快，如果實(shí)驗(yàn)所用孔數(shù)量多，請(qǐng)將所需數(shù)量的滴瓶中液體轉(zhuǎn)移至V型試劑槽中，并用多通道移液器加液。）在450nm處測(cè)量吸光度值以空氣為空白，必須在加入停止液后60分鐘內(nèi)讀取光度值。

11.   結(jié)果

定量分析：所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn) （0標(biāo)準(zhǔn)） 的吸光度值再乘以100。因此0標(biāo)準(zhǔn)等于100%并且以百分比給出吸光度值。

標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值（或樣品）

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－-× 100  =   %吸光度值

0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值

計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成為一個(gè)對(duì)應(yīng)T-2 毒素濃度（?g/kg）的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖。

試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍在0.2-0.8ppb之間。

相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度（?g/kg）可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。

為了得到樣品的實(shí)際濃度，還應(yīng)將從曲線上讀出的濃度值乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

谷物和飼料……………………………35或350

所以，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍應(yīng)該是從3.5-56ppb或是從35-560ppb。

12．檢測(cè)下限

RIDASCREEN T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線

T-2毒素試劑盒的檢測(cè)下限為0.1ppb。對(duì)于谷物和飼料來(lái)說(shuō)，要考慮樣品的稀釋倍數(shù)，所以試劑盒的檢測(cè)下限為3.5ppb。

13. 交叉反應(yīng)

14. 回收率

谷物及飼料…………………………………………約90%