凍存管使用不當(dāng)， 會有爆、生物安全威脅及人身傷害等風(fēng)險凍存管使用不當(dāng)， 會有爆、生物安全威脅及人身傷害等風(fēng)險凍存管使用不當(dāng)，會有爆、生物安全威脅及人身傷害等風(fēng)險

細(xì)胞凍存流程 細(xì)胞凍存流程

用預(yù)熱過的 PBS 對細(xì)胞進行沖洗，棄去 對細(xì)胞進行沖洗，棄去 PBS 后，加入含 后，加入含 后，加入含 EDTAEDTAEDTAEDTA的胰酶消 化液對細(xì)胞進行消（薄地覆蓋表面即可，濃度須 化液對細(xì)胞進行消（薄地覆蓋表面即可，濃度須 化液對細(xì)胞進行消（薄地覆蓋表面即可，濃度須 根據(jù)不同的細(xì)胞系進行調(diào)整）。 根據(jù)不同的細(xì)胞系進行調(diào)整）。

37 ℃消化 細(xì)胞 3–5分鐘，不可過度消化。

一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化并吸管輕吹 一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化并吸管輕吹 一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化并吸管輕吹 一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化并吸管輕吹 一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化并吸管輕吹 打以重懸細(xì)胞 。

離心（ 500 00 00 × g, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 min）細(xì)胞重懸液以沉淀， ）細(xì)胞重懸液以沉淀， 棄上清， 用含血清培養(yǎng) 基對細(xì)胞沉淀進行重懸。

對細(xì)胞進行計數(shù)（推薦 Neubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamber Neubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamber）。

離心（ 500 500 500 500 × g, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 min）細(xì)胞重懸液，棄上清。用適當(dāng)體積含血培養(yǎng)基 ）細(xì)胞重懸液，棄上清。用適當(dāng)體積含血培養(yǎng)基 重懸細(xì)胞。

將細(xì)胞重懸液以 1:11:1 比例與凍存液（ 比例與凍存液（ 60% 培養(yǎng)基， 培養(yǎng)基， 20% FCS20% FCS20% FCS 20% FCS 20% FCS，20% DMSO20% DMSO20% DMSO20% DMSO20% DMSO20% DMSO20% DMSO20% DMSO） 進行混合后轉(zhuǎn)移至 Cryo.sCryo.sCryo.s Cryo.sCryo.sTM 凍存管中。細(xì)胞的濃度應(yīng)為 1–5 × 10 6 細(xì)胞 /ml 。

含有細(xì)胞的凍存管須按照 .1 K/min1 K/min1 K/min1 K/min1 K/min1 K/min1 K/min的冷卻速率進行凍。將存管插在 的冷卻速率進行凍。將存管插在 的冷卻速率進行凍。將存管插在 含異丙醇的凍存 盒小室并放置在 .70 ℃的冰箱中可以實現(xiàn)上述要求。如果 的冰箱中可以實現(xiàn)上述要求。如果 的冰箱中可以實現(xiàn)上述要求。如果 凍存液中含有其他類型的樣品時，則需要將 凍存液中含有其他類型的樣品時，則需要將 Cryo.sCryo.sCryo.s Cryo.sCryo.sTM 凍存管在 .20 ℃， .70 ℃或者液氮的氣相層進行 直接 凍存。為確保每個樣品的均一效 果， 4 ml 和 5 ml 的 Cryo.sCryo.sCryo.s Cryo.sCryo.sTM 凍存管需在 .20 ℃過夜凍存后再轉(zhuǎn)移至 70 ℃ 或者液氮的氣 相層。

然后將 Cryo.sCryo.sCryo.s Cryo.sCryo.sTM 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐。為避免污染（例如支原體）并考 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐。為避免污染（例如支原體）并考 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐。為避免污染（例如支原體）并考 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐。為避免污染（例如支原體）并考 慮到安全預(yù)防規(guī)范的要求，建議將 慮到安全預(yù)防規(guī)范的要求，建議將 Cryo.sCryo.sCryo.s Cryo.sCryo.sTM 凍存管放置在 液氮上方的氣 相層而非液氮。

細(xì)胞復(fù)蘇流程

從液氮罐中取出凍存管后立即將其置于37℃水浴中進行解凍，解凍時間約1–2min，解凍時需要不停搖動凍存管令其盡快融化。此步解凍過程越快越好。

將解凍好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管，并立即添加一定量含血清培養(yǎng)基進行混合。

離心（500 ×g, 5 min）細(xì)胞重懸液，棄去上清。用適當(dāng)體積的含血清培養(yǎng)基對細(xì)胞沉淀進行重懸后分裝到1個或多個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

請遵循細(xì)胞接種時的推薦濃度進行培養(yǎng)。

接下來的12個小時細(xì)胞需要靜置培養(yǎng)。

細(xì)胞換液可在24–48h后進行。

Cryo.sTM凍存管安全使用建議

使用凍存管儲存樣本時，嚴(yán)格要求應(yīng)把凍存管放入液氮的氣相層或冰箱中保存！如果凍存管儲存于液氮液體中，液氮有一定幾率會滲入凍存管內(nèi)部，復(fù)蘇時液氮氣化導(dǎo)致管內(nèi)外壓力不平衡，這樣極易造成凍存管的炸裂，并具有生物危害性。

操作凍存管復(fù)蘇，全程使用安全防護設(shè)備，建議穿實驗服、戴棉質(zhì)手套且在安全的實驗臺上進行操作。條件允許情況下，請佩戴護目鏡或防護面罩。由于夏季室內(nèi)溫度會高于冬季，請格外小心。

凍存細(xì)胞儲存過程中，凍存管的冷凍溫度須均勻。不均勻的受凍將會導(dǎo)致冰塞的產(chǎn)生，冰塞會抑制兩側(cè)的液體溫度傳遞進而產(chǎn)生危險的高壓力并導(dǎo)致凍存管受損。

凍存的樣本量不要超過凍存管要求的工作體積。

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