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人乙酰膽堿Elisa試劑盒上海恒遠說明書

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上傳時間：2015/3/25 15:29:40

文件類型：jpg

上 傳 者：恒遠免疫學第三方檢測中心

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                       人乙酰膽堿（ACH）Elisa試劑盒由上海恒遠生物供應

貨號：HY-11525K

人乙酰膽堿(ACH)ELISA試劑盒
                          Human acetylcholine,ACH ELISA KIT                                                                    

用途

本試劑盒僅供科研使用，定量檢測細胞液、體液、組織、血清、血漿等標本中人乙酰膽堿（ACH）的含量。

原理:

采用雙抗體夾心法測定人乙酰膽堿（ACH）水平。用純化的人乙酰膽堿（ACH）抗體包被微孔板，制成固相載體，實驗時依次在微孔板中加入樣本及標準品，并加入HRP標記的ACH抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，反復洗滌后加底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍色，再用硫酸終止反應，轉(zhuǎn)變成黃色。顏色的深淺和樣品中的ACH含量呈正相關(guān)。采用酶標儀在450nm波長測定吸光度（OD值），根據(jù)標準曲線，計算測試樣品中ACH濃度。          

試劑盒組成

 

序號

名稱

規(guī)格

1

酶標包被板

96孔*1可拆卸板

2

酶標試劑

6ml*1瓶

3

標準品(濃度2000 pg/ml)

0.6ml*1瓶

4

標準品稀釋液

2ml*1瓶

5

生物素標記的抗ACH抗體

1.5ml*1瓶

6

顯色劑A液

6ml*1瓶

7

顯色劑B液

6ml*1瓶

8

終止液

6ml*1瓶

9

濃縮洗滌液（*30）

20ml*1瓶

10

封板膜

1張

11

使用說明書

1份

實驗材料與試劑配制：

1.   儀器與材料：酶標儀（使用前預熱30分鐘），微量加液器、吸頭、蒸餾水或去離子水，濾紙。

2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液備用。

樣品收集、處理及保存

1.   細胞培養(yǎng)上清：適用于檢測體外培養(yǎng)的細胞分泌性成份。用無菌管收集細胞上清液，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

2.   細胞：用PBS反復洗滌細胞3次，調(diào)整細胞濃度達到104-106/ml 左右，通過反復凍融，使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份，或者細胞超聲粉碎，離心取上清液檢測。

3.   血清：在室溫下，血液自然凝固，以1000×g離心15分鐘，取上清待測。

4.   血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合后靜置10-20 分鐘后，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

5.   體液：包括胸腹水、腦脊液，分泌物等。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

6.   組織標本：切取組織標本，稱取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或勻漿器，或超聲破碎儀將標本勻漿，以2000-3000 rmp離心20 分鐘，收集上清進行檢測。

7.   樣品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

8.   保存：如果樣品不能立即檢測，應將其分裝，-70 ℃保存，避免反復冷凍。保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。血液標本盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

 

操作步驟：

1.   取出試劑盒，室溫（20-25℃）放置30分鐘。

2.   分組：取出96孔板，根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理。分別設(shè)標準品組（6個濃度）、空白孔、待測樣品組。

標準品的稀釋：準備小試管6 只，依次編好號碼，先在各小試管中加入標準品稀釋液100ul，然后取原濃度標準品100ul加入一只已編好號的試管中，充分混勻;再在該試管中取100ul 加入第二支試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第三只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第四只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第五只試管中，充分混勻；然后在該試管中取100ul，棄掉。第六只試管作為0 號標準品。稀釋后各管濃度分別是：1000 pg/ml,500 pg/ml,250 pg/ml, pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml,0 pg/ml。

注：為減少實驗誤差，保證準確性，建議設(shè)置復孔。

3.   加樣：依照標準品的順序分別加入50ul的標準品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入50ul的蒸餾水；其余微孔中先加樣品40ul然后再加生物素標記的抗ACH 抗體10ul。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復5 次，拍干。

6.   加酶標溶液：標準品組、待測樣本組各孔中加入50ul的酶標溶液（空白對照孔除外）。

7.   溫育：酶標板用封板紙密封后，放入濕盒內(nèi)于37℃恒溫孵育1小時。

8.   洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置15-30s，充分清洗酶標板5次，用吸水紙徹底拍干。

9.   顯色：各孔加入顯色劑A液50ul后，再加入顯色劑B液50ul。

10.   終止：25-37℃下避光反應10-15分鐘，加入50ul終止液。

11.   讀板：在450nm波長讀取各孔的OD值。

注：讀板時必須拭干板底殘留的液體和手指痕跡，讀板時間控制在終止反應后的30分鐘內(nèi)，以免影響準確性。

數(shù)據(jù)計算

1.   繪制標準曲線：各標準品OD值減去底色即減去空白孔OD值，以6個標準品的OD值為縱坐標y，以標準品的濃度為橫坐標x，繪制曲線圖，如圖示，并計算出回歸方程y=ax+b。

2.   將待測樣品的OD值代入方程式，計算各組樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際ACH濃度。

3.   敏感度：1.0 pg/ml

 

注意事項：

1.   實驗操作中必須使用一次性吸頭，避免交叉污染。

2.   加樣：加樣時，要控制加樣速度，避免孔與*后一孔間的時間間隔過大，否則將會導致不同的預孵育時間，從而影響實驗的準確性以及重復性。

3.   孵育：嚴格按照說明書上規(guī)定的孵育時間和溫度進行。

4.   反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化，如果顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應。

5.   建議實驗前預測樣品含量，如樣品濃度過高，應對樣品進行稀釋，計算結(jié)果時乘以相應的稀釋倍數(shù)。

6.   建議使用本試劑盒時先做預實驗（即先做標準曲線，試用幾個標本），如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經(jīng)銷商聯(lián)系，如果因運輸過程導致試劑盒失效，可要求調(diào)換，但概不承擔產(chǎn)品本身以外的任何損失。

安全性

1． 避免人體直接接觸顯色劑A、B和終止液。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2． 實驗中不要進食、抽煙或使用化妝品。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：2-8℃

2.有效期：6個月

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