回顧分子生物學(xué)的發(fā)展歷程，PCR技術(shù)的發(fā)明和普及無疑是最重要的篇章之一。而PCR技術(shù)在近20年的不斷發(fā)展創(chuàng)新中，最受矚目當(dāng)屬熒光實時定量PCR技術(shù)real-time quantitative PCR, or qPCR。定量PCR技術(shù)真正實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，通過對PCR過程的實時監(jiān)控，專一、靈敏快速、可重復(fù)地精確定量起始模版濃度，已經(jīng)在科研和臨床診斷領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。我公司從熒光定量PCR的原理入手，詳細(xì)介紹熒光定量PCR儀的類型和技術(shù)，為定量PCR儀的選擇提供詳細(xì)參考。
    定量PCR儀主要由兩部分組成，一個是PCR系統(tǒng)，一個是熒光檢測系統(tǒng)。從前面的原理介紹不難看出選擇定量PCR儀的關(guān)鍵－－由于定量PCR必需借助樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的對比來實現(xiàn)定量的，對于定量PCR系統(tǒng)來說，重要的參數(shù)除了傳統(tǒng)PCR的溫控精確性、升降溫速度等等，更重要的還在于樣品孔之間的均一性，以避免微小的差別被指數(shù)級放大。至于熒光檢測系統(tǒng)，多色多通道檢測是當(dāng)今的主流趨勢－－儀器的激發(fā)通道越多，儀器適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬；多通道指可同時檢測一個樣品中的多種熒光，儀器就可以同時檢測單管內(nèi)多模版或者內(nèi)標(biāo)+樣品，通道越多，儀器適用范圍越寬、性能就更強(qiáng)大。熒光檢測系統(tǒng)主要包括激發(fā)光源和檢測器。激發(fā)光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發(fā)光二極管LED光源，前者可配多色濾光鏡實現(xiàn)不同激發(fā)波長，而單色發(fā)光二極管LED價格低、能耗少、壽命長，不過因為是單色，需要不同的LED才能更好地實現(xiàn)不同激發(fā)波長。監(jiān)測系統(tǒng)有超低溫CCD成像系統(tǒng)和PMT光電倍增管，前者可以一次對多點(diǎn)成像，后者靈敏度高但一次只能掃描一個樣品，需要通過逐個掃描實現(xiàn)多樣品檢測，對于大量樣品來說需要較長的時間。定量PCR儀需要考慮的另外一個因素是軟件設(shè)計，這一點(diǎn)目前較新型號的儀器都有不錯的配套軟件可以滿足常規(guī)使用。－－隨著定量PCR技術(shù)在臨床診斷、疾病監(jiān)控、藥物監(jiān)測、腫瘤研究等領(lǐng)域的越來越廣泛的應(yīng)用，市面上不同品牌和設(shè)計的定量PCR儀也不斷推陳出新，在這里著重介紹不同的3類定量PCR儀，各有各精彩。

傳統(tǒng)的48孔/96孔板式定量PCR儀
    傳統(tǒng)的48孔/96孔板式定量PCR儀以美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI為代表。傳統(tǒng)48孔/96孔板式定量PCR儀的優(yōu)點(diǎn)是可容納的樣本量大而且無需特殊耗材，可以采用傳統(tǒng)的96孔板或48孔板進(jìn)行批量的定量反應(yīng)，但是缺點(diǎn)也顯而易見－－溫度均一性不佳－－平板固定加熱模塊的PCR溫度控制有邊緣效應(yīng)－－樣品槽上每個孔之間的溫度存在差異－－也就是所謂位置效應(yīng)，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件應(yīng)難以做到與樣本完全一致，樣本和樣本之間的溫度控制也可能存在差異，對于靈敏度極高的定量PCR來說，任何極微小的差異都會以指數(shù)級別的規(guī)模被放大，不能不說是一種缺憾。傳統(tǒng)反應(yīng)板面積大，溫度控制的精確性、升降溫速度也相對較慢，因而反應(yīng)速度也較慢。96孔板定量PCR儀的熒光檢測分析系統(tǒng)，由于96孔板上樣品孔的位置是固定的，每個樣品孔距離光源和監(jiān)測器的光程各不相同，有可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。檢測在試管管底進(jìn)行，試管底的透光性和厚薄均一性都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。MJ和Bio-Red公司以及西安天隆的定量PCR儀也屬于這一類。

ABI的7500型熒光定量PCR儀激發(fā)光源為鹵鎢燈光源，5色濾光鏡，可同時激發(fā)96個樣品，超低溫CCD具備同時多點(diǎn)多色檢測的能力，能夠有效地分辨FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5等熒光染料。多色熒光檢測技術(shù)為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽性內(nèi)對照的陰/陽性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時對多個目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。隨機(jī)配置的定量PCR引物和探針設(shè)計軟件Primer Express非常有用，“因為到目前為止還沒有其他軟件有能力設(shè)計定量PCR所需的TaqMan探針摘自ABI技術(shù)資料”。 各型號都有實時動態(tài)Real-Time和終點(diǎn)讀板Plate Read兩種運(yùn)行模式。實時動態(tài)模式用于定量DNA或RNA拷貝數(shù)�？梢詣討B(tài)顯示PCR擴(kuò)增曲線的生成，定量的線性范圍大于9個數(shù)量級，區(qū)分5000和10000個拷貝的DNA模板可信度達(dá)99.7%。終點(diǎn)讀板模式用于基因型鑒定、點(diǎn)突變檢測和單核苷酸多態(tài)性SNP分析等。當(dāng)然，也可以作為普通PCR儀使用。ABI定量PCR儀最大的優(yōu)勢在于ABI已經(jīng)發(fā)布十二萬種Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因組基因表達(dá)分析試劑盒，覆蓋人類全部4萬個基因，二百萬種Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因組SNP檢測試劑盒，為運(yùn)用7000、7300、7500、7900型開展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。ABI 的定量PCR儀均支持兩種定量化學(xué)：TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線Dissociation Curve功能用于判斷PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否特異，有無雜帶生成。7500型號比7300多一個濾光鏡，新的光路設(shè)計使長波長紅色熒光的檢測靈敏度大大提高，帶有快速運(yùn)行模式。增強(qiáng)的7900型在96孔模塊的基礎(chǔ)上更加可以更換384孔版模塊，使得高通量處理數(shù)據(jù)的能力大大增強(qiáng)，應(yīng)該更適合經(jīng)常處理大量標(biāo)本的實驗室吧。

Bio-Rad伯樂也是大家熟悉的品牌，iCycler iQ實時定量PCR系統(tǒng)也是96孔平板式固定加熱的，熒光檢測波長范圍400-700nm，可4波長同時檢測，儀器的設(shè)計靈活，定性和定量部分可獨(dú)立工作，同樣可完成梯度PCR。5組濾光片位置使用戶可以自由選擇不同的檢測波長。專利技術(shù)intensifier熒光放大器保證了極高的檢測靈敏度。MJ的Option系列是在MJ原來的常規(guī)PCR儀基礎(chǔ)上改造，采用LED光源PMT光電倍增管熒光檢測器。 96個單色LED光源對應(yīng)96孔板，但是單色LED激發(fā)波長范圍窄。Option是單道單個光電倍增管熒光檢測器，升級的Option2是雙PMT光電倍增管熒光檢測器，PMT靈敏度高但一次只能掃描一個樣品，所以O(shè)ption系列是逐孔掃描而非同時檢測96個樣品。雙PMT可同時進(jìn)行雙色檢測FAM/SYBR Green I；VIC/Joe/TAMRA。優(yōu)勢之一是帶梯度功能。MJ被Bio-Rad收購后，Option和iCycler iQ目前還是各自走各自的銷售渠道，至于將來Bio-Rad會如何決定二者的發(fā)展方向還需要拭目以待。

創(chuàng)新概念的離心式實時定量PCR儀
    為了克服平板式定量PCR溫度均一性差的缺點(diǎn)，聰明的研究人員又開發(fā)出創(chuàng)新概念的離心式實時定量PCR儀，以Roche羅氏的Lightcycle和Corbett的Rotor-gene為代表。PCR擴(kuò)增樣品槽被巧妙地設(shè)計為離心轉(zhuǎn)子的模樣，借助空氣加熱和轉(zhuǎn)子在腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)子上每個孔都是“等位”的，幾乎無差別，很好的解決了每個樣品孔之間的溫度均一性的關(guān)鍵問題－－Corbett的Rotor-gene樣品間溫度差異小于±0.01℃，最大程度地保障了標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品之間條件的一致性。利用空氣做加熱介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)在于能實現(xiàn)與反應(yīng)體系無縫接觸，接觸面積大且加熱均勻。雖然有競爭對手批評空氣介質(zhì)比熱小，但事實上Roche的Lightcycle 2.0卻是目前升溫速度最快的定量PCR儀，可以達(dá)到20℃/秒！Corbett的Rotor-gene也可以達(dá)到5℃/秒樣品實際升溫速度達(dá)到2.5℃/秒，優(yōu)于多數(shù)的平板式PCR儀。借助旋轉(zhuǎn)離心力還可以隨時將可能凝在管壁和蓋子上的液滴離心到管底而無需熱蓋；還可以將酶加在管蓋上，升溫后離心到管底與反應(yīng)體系混合，實現(xiàn)“機(jī)械的熱啟動功能”。由于升溫速度快，對于常規(guī)需要2個多小時完成的定量PCR反應(yīng)，Roche的LightCycler僅需20-30分鐘即可完成，可以大大節(jié)約時間和提高工作效率。這一點(diǎn)對于研究人員來說極為有用，因為你不再需要等2個多小時才能看實驗結(jié)果了，或者換句話來說，2個多小時你可以做4-5輪定量實驗了。

由于轉(zhuǎn)子上的樣品孔是旋轉(zhuǎn)可移動的，因而離心式熒光檢測系統(tǒng)可以固定激發(fā)光源和熒光檢測器，隨時檢測旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品管－－由于每個樣品管在檢測時距離檢測器和激發(fā)光源的距離都是“等價”一樣的，使用的是同一個檢測器和激發(fā)光源，有效減少不必要的系統(tǒng)誤差。固定的結(jié)構(gòu)使得儀器運(yùn)行更穩(wěn)定，使用壽命更長；離心式定量PCR都是逐個檢測樣品的，所以大多采用了長壽的LED（發(fā)光二極管）冷光源，運(yùn)行前無須預(yù)熱，無須校正；系統(tǒng)檢測重復(fù)性也更好。

離心式定量PCR儀的缺點(diǎn)主要是離心的轉(zhuǎn)子小，能容納的樣本量有限，由于是離心式轉(zhuǎn)子，常規(guī)的96孔板和條形管就不適用，有的還需要特殊的消耗品，增加使用成本。當(dāng)然離心式定量PCR儀不可能帶梯度功能。

第三類的熒光定量PCR儀以Cepheid公司的Smart CyclerII為代表，對于國內(nèi)的用戶來說比較新鮮，但這個一直受美國國防部和安全局、美國軍隊傳染病醫(yī)學(xué)研究中心、美國軍隊士兵和生物化學(xué)合作所資助的公司卻相當(dāng)有來頭。Smart CyclerII獲得過1998年美國研發(fā)R&D100金獎。Smart CyclerII的機(jī)型小巧，只有16個樣品槽，它的獨(dú)到之處在于這16個樣品槽分別擁有獨(dú)立的智能升降溫模塊，也就是說這16個樣品槽相當(dāng)于16臺獨(dú)立的定量PCR儀！獨(dú)立控溫的好處首先是，你可以在同一定量PCR儀上分別進(jìn)行不同條件的定量PCR反應(yīng)，更為靈活自定義的梯度優(yōu)化反應(yīng)也好，或者是完全不同的幾組反應(yīng)－－甚至，你可能只進(jìn)行個別樣品的檢測，只占用其中幾個樣品槽－－過一會兒其它的同事也要用－－他不需要等待你的反應(yīng)結(jié)束，而可以隨時利用空置的樣品槽開始其它定量反應(yīng)！對于各有各忙的多成員的實驗室，要是個別樣品就占據(jù)96孔樣品槽，其它人每輪要再等2個多小時，有時還要等幾輪，那可夠郁悶的。Smart Cycler II的使用頻率可以被最大化，大家都不用等待！這個世界上唯一允許不同條件PCR同時進(jìn)行的定量PCR儀擁有獨(dú)一無二的優(yōu)點(diǎn)，是其它任何平板式或者離心式定量PCR都不具備的。

在選購定量PCR前之前我們需要先了解自己的需要－－是同時檢測大量樣本？還是小規(guī)模的研究？是固定的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法還是有機(jī)會嘗試不同的方法？隨著技術(shù)的加速發(fā)展不斷有新的熒光素、標(biāo)記方法和試劑盒面市，還要考慮儀器性能在將來的可拓展性等等。了解不同類型的定量PCR儀的特點(diǎn)有助于選擇更適合自己需要的儀器，“不求最好，但求適合”。

西安天隆TL988型實時熒光定量PCR儀產(chǎn)品特點(diǎn)

n         一體機(jī)設(shè)計，PCR擴(kuò)增反應(yīng)和熒光激發(fā)檢測一次完成，檢測周期大大縮短，且避免了基因擴(kuò)增到熒光檢測使用不同儀器必須轉(zhuǎn)移待測樣本而引起污染。完成一個標(biāo)準(zhǔn)兩步PCR擴(kuò)增反應(yīng)和定量熒光檢測只需45～70分鐘（因試劑而異）。而定性PCR須3～4小時，酶免終點(diǎn)定量須6～8小時，熒光終點(diǎn)定量須2～3小時。

n         應(yīng)用專利技術(shù)實現(xiàn)快速高效均衡擴(kuò)增檢測。由光開關(guān)、自聚焦透鏡和尾纖準(zhǔn)直器及變增益O/E裝置組成的MOMENS有機(jī)整體，在以16位MCU為核心的電控裝置管理下，能在毫秒級時間內(nèi)完成對全部標(biāo)本快速均衡掃描檢測，避免了機(jī)械掃描方式或CCD掃描方式引起的時間之后或漸暈誤差，實現(xiàn)高通量實時熒光激發(fā)和定量檢測。

n         采用先進(jìn)膜加熱及半導(dǎo)體熱泵制冷技術(shù)保證了升降溫的快速準(zhǔn)確穩(wěn)定。半導(dǎo)體熱電模塊技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)今世界PCR儀的發(fā)展主流。

n         加有熱蓋設(shè)計保證了無礦物油操作，避免了人為原因造成的污染。

n         激發(fā)光源采用長壽命LED，終身免維護(hù)。

n         采用日本原產(chǎn)光電倍增管和美國原產(chǎn)濾光片，保證檢測的高靈敏度和高精確度。

n         良好的線性范圍達(dá)10⁰～10¹⁰，、靈敏度最小分辨率為1拷貝，重復(fù)性CV≤1％。

n         樣本載臺參照0.2ml薄壁PCR離心管設(shè)計，通用性好。

n         友好簡體中文Windows操作界面更符合國人操作，多個標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)填空式輸入和參數(shù)輸入提示保證了參數(shù)輸入的有效性。

n         每個程序段數(shù)多達(dá)9個；每個程序的步驟多達(dá)9個；每個程序的循環(huán)數(shù)多達(dá)99個，溫度、循環(huán)等多個參數(shù)的多種修正、調(diào)節(jié)方式，可完全滿足臨床即科研上試驗的要求。

n         強(qiáng)大的軟件數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)提供完整的病歷檔案、集成化的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)、圖表顯示、自動試劑及結(jié)果跟蹤。

n         軟件在線升級。

n         根據(jù)用戶需要可特別改變檢測熒光波長。

n         國人設(shè)計，關(guān)鍵部件全部采用優(yōu)質(zhì)進(jìn)口原料，性能達(dá)到進(jìn)口原裝水平。

n         國產(chǎn)儀器的價格，進(jìn)口儀器的性能。

性能參數(shù)

技術(shù)原理：標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強(qiáng)度，求得CT值，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照，即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。

標(biāo)本載體：0.2ml薄壁PCR離心管

標(biāo)本數(shù)量：標(biāo)本數(shù)量48個，包括4個標(biāo)準(zhǔn)品

試劑：SYBR Green I，F(xiàn)AM，Tex Red，F(xiàn)ITC等熒光染料，開放式PCR試劑

反應(yīng)體系：10-100μL

建議質(zhì)控：四個陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照

指標(biāo)

熒光激發(fā)波長：470nm

熒光發(fā)射波長：530nm，640nm，710nm；570mm，605mm

熒光檢測方式：光開關(guān)陣列組合光電倍增管PMT方式

控溫范圍：4.0℃-99.0℃

熱蓋溫度：100℃～120℃

升/降溫速度：≥4.0℃/S（Max）

溫度均勻性：≤±0.3℃

溫度精確度：≤±0.3℃

溫度顯示精度：0.1℃

檢測范圍：10¹～10¹⁰DNA/RNA copy/ml

CT值重復(fù)性誤差：CV≤2.1％

核酸精度相關(guān)系數(shù)：R≥0.997

軟件

溫階：1～9

循環(huán)：1～99

保溫時間：1～9999秒

文件：1～9個連接

升級方式：遠(yuǎn)程硬件內(nèi)控軟件升級

系統(tǒng)接口：RS-232C串行接口，雙向數(shù)據(jù)

主機(jī)操作系統(tǒng)：Windows2000/XP

產(chǎn)品外形尺寸：50cm × 40cm × 35cm

產(chǎn)品重量：25kg

使用環(huán)境：溫度5～40℃，相對濕度≤80％

使用電源：AC220 × 1±10%V,50 × 1±2%HZ

功耗：1100VA

多規(guī)格：提供96孔，多通道/多色、36孔等不同規(guī)格產(chǎn)品

制造商：西安天隆科技有限公司

地址：西安市東開發(fā)區(qū)火炬路4號樓5層

聯(lián)系人：蘆先生

電話：86-29-82682132

傳真：86-29-82216680