HPLC分析是系統的工作，每個環(huán)節(jié)都很重要；看似簡單的環(huán)節(jié)，反而容易疏忽，引起整個實驗的結果偏差，因此養(yǎng)成良好的習慣是很重要的。色譜柱是色譜系統的心臟，液相色譜柱的正確安裝與使用，是色譜工作的關鍵；也是獲得正確可靠的實驗數據的必經之路。

一·液相色譜柱的安裝

1         液相色譜柱的結構：

a．空柱由柱接頭柱管及濾片組裝而成

柱接頭采用低死體積結構，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英才外螺紋，另一端是3/16英才的內螺紋（國內外已規(guī)范化）。7/16英才外螺紋與1/4英寸柱管（￠6.35mm）連接，中間放置壓環(huán)用于密封。3/16英才的內螺紋與1/16英才（￠1.57mm）的連接管連接，之間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用￠1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后在擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上（連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應嚴格控制在2.5mm長或其他固定尺寸。

在兩端柱接頭內，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或濾網），用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外流失�？罩�各組件均為316#不銹鋼材質，能耐受一般的溶劑作用。但含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。

b．  柱填料：

液相色譜柱的分離作用是在填料和流動相之間進行的，柱子的分類是根據填料類型而定。

正相柱：多以硅膠為填料。根據外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3-10um的范圍內。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，—NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。

反相柱：主要是以硅膠為基質，在其表面鍵合十八烷基官能團（ODS）的非極性填料。也有無定型和球型之分。常用的其他反相填料還有鍵合C8，C4，C2，苯基等，其顆粒直徑在3-10um之間。

2         色譜柱的安裝

a．  拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型，尺寸，出廠日期以及柱內儲存的溶劑。

b．  擰下柱兩端的密封堵頭放回包裝盒備用。

c．  按柱管上標示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口連接（如條件允許，建議在柱前使用保護柱）；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為.57mm、內徑為0.1mm-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時一定要設法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止，再用扳手繼續(xù)順時針擰1/4-1/2圈，切記不要用力太大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏夜現象，請用扳手順時針擰1/4圈，直至不漏夜為止。

二·液相色譜柱的使用：

色譜柱在使用前，最好進行的柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是最佳條件），只要這樣測試的結果才有可比性。

1         樣品的前處理：

a．  最好使用流動相溶解樣品。

b．  使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。

c．  使用0.45um的過濾膜除去微粒雜質。

2         流動相的配置：

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

a．  流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。

b．  流動相具有一定的惰性，與樣品不產生化學反應（特殊情況除外）。

c．  流動相的黏度要盡量的小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液壓泵的使用壽命（可運行提高溫度的方法降低流動相的黏度）。

d．  流動相的化學性質要與使用的檢測器相適應。如用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

e．  流動相的沸點不要太低，負責容易產生氣泡，導致實驗無法進行。

f．   在流動相配置好后，一定進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

3         流動相流速的選擇：

因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內徑為4.6 mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。

當選用最佳流速時，分析時間可能延長�？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間（如反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。

注意：

1）.由于甲醇的廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙腈的除外）。

2）.對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的乙烷做流動相，沒有提純的乙烷不的使用。用水最好使用超純水（電阻率大于18兆歐），去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質，有可能影響分析的結果。

3）.含水流動相最好在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細菌的生長。

4）.流動相要求使用0.45um濾膜過濾，除去微粒雜質。

5）.使用HPLC級溶劑配置流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

4        柱性能的測試：

——啟動液相色譜儀：a. 流動相流速設定為1ml/min。

                                    b．UV檢測器波長設定為254nm。

——使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品。

——記錄并計算測試結果。