2001年5月，F(xiàn)DA首次頒布了官方生物分析方法指導(dǎo)¹。該題為《工業(yè)生物分析方法驗(yàn)證指南》的文件作為生物分析方法指南，用來支持臨床和非臨床研究。

最近，美國藥學(xué)科學(xué)家協(xié)會（AAPS）會刊中題為“車間/會議報(bào)告----定量生物分析方法驗(yàn)證和執(zhí)行：色譜和配體法最好的實(shí)踐”的文章²列出，實(shí)物標(biāo)樣測得濃度的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度成為具有影響的爭辯的論題。有建議提出，在已經(jīng)測試的實(shí)物標(biāo)樣隨機(jī)抽取樣品重新測試，并與原值進(jìn)行比較，以保證重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。與原始測量數(shù)據(jù)具有顯著性差異（>15-20%）的，需要對生物分析方法進(jìn)行重新評估

驗(yàn)證生物分析方法有效的靈敏度和重現(xiàn)性是藥物的藥物動力學(xué)（PK）、藥物生物利用度和生物等效性產(chǎn)生可靠數(shù)據(jù)的先決條件。方法驗(yàn)證證明一種生物分析方法可以符合《工業(yè)生物分析方法驗(yàn)證指南》建議的最低標(biāo)準(zhǔn)，即，具有準(zhǔn)確度、精密度、選擇性、靈敏度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。然而，重復(fù)暴露于生物基質(zhì)中，保證一個驗(yàn)證生物分析方法在定量下限的精密度和準(zhǔn)確度對每一個生物分析實(shí)驗(yàn)室都是一個挑戰(zhàn)。

本研究的目標(biāo)是證明Thermo Scientific公司生產(chǎn)的TSQ Vantage儀在測試大鼠血漿中帕羅西汀的高靈敏度生物分析實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的耐受性和重現(xiàn)性。將帕羅西汀加于大鼠血漿中，作為包括空白樣品、標(biāo)樣、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)（QCs）的一批樣品進(jìn)樣測試。整批樣品包括1000個血漿樣品，用來疊加5個標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個標(biāo)準(zhǔn)曲線200次進(jìn)樣，用來測試重現(xiàn)性和離子源的耐受穩(wěn)定性。

 

HPLC泵：Thermo Scientific公司的Accela™ 泵（Thermo Fisher Scientific，San Jose, CA）

自動進(jìn)樣器：CTC PAL (CTC Analytics，Basel，瑞士)

色譜柱：Thermo Scientific公司的Hypersil GOLD™ C18，50mm× 2.1 mm (3μm) （Thermo Fisher Scientific，Bellefonte，PA）

HPLC方法：線性梯度，5min內(nèi)淋洗液B（乙腈，0.1%甲酸）含量從10%到95%，淋洗液A為0.1%甲酸的水溶液；流速：1mL/min；進(jìn)樣體積：10μL

質(zhì)譜儀：TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)

離子化模式：HESI-II，正離子模式

 

重現(xiàn)性是生物分析方法的一個重要參數(shù)。一種驗(yàn)證的生物分析方法經(jīng)常因?yàn)樯�物基質(zhì)所含成分，例如蛋白質(zhì)、鹽分、糖、磷脂和其它成分的連續(xù)沉積而受限。保證長效的準(zhǔn)確度和精密度的一個關(guān)鍵要素是一個可以非常耐受生物分析樣品中的非揮發(fā)物的存在的穩(wěn)健的離子源³。如圖1所示，TSQ Vantage在不斷暴露于含生物基質(zhì)的樣品之后，仍然可以在高靈敏度下保持良好的重現(xiàn)性。圖中在5天內(nèi)分析1000個大鼠血漿樣品（每天200個樣品）的過程中，每天測得一個標(biāo)準(zhǔn)曲線，共5個標(biāo)準(zhǔn)曲線（1-500 pg/mL）。該圖將5個標(biāo)準(zhǔn)曲線疊放以論證離子源的耐受穩(wěn)定性。

圖2所示為第一天、第三天和第五天的定量下限的色譜圖。盡管系統(tǒng)暴露在1000個大鼠血漿樣品下，第一天和第五天的信噪比（S/N）基本上沒有差別。重現(xiàn)性的穩(wěn)定性在5天內(nèi)所測得的面積比的準(zhǔn)確度（系統(tǒng)偏差）和精密度（隨機(jī)誤差）上得到體現(xiàn)（見表1）。離子源在高靈敏度下良好的重現(xiàn)性能表現(xiàn)在，定量下限的%CV為5.44%，定量上線的%CV為1.00%。計(jì)算濃度（見表2）就變得非常重要，因?yàn)檎�是這些值最終影響到PK參數(shù)的研究。

 

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