D101/HP20大孔吸附樹脂分離純化羅漢果皂甙的新方法

大孔樹脂的預(yù)處理
    將新大孔樹脂于95% 乙醇溶液中浸洗8 h 后, 用蒸餾水清洗至無醇味, 再用5% 氫氧化鈉浸泡4 h, 用蒸餾水洗至pH 值中性后, 接著用5% 鹽酸浸泡4 h, 再用蒸餾水洗至pH 中性。濕法裝柱, 一次完成, 自然沉降。

大孔樹脂堆積密度的測定
    取一標(biāo)準(zhǔn)玻璃層析柱(26 mm ×500 mm ) 將濕大孔樹脂堆至100 mL , 取出, 稱重。按下式計(jì)算大孔樹脂的堆積密度:
Q= m/v
    式中　m —— 濕樹脂質(zhì)量, g; v —— 樹脂體積,mL ;Q—— 堆積密度, g/mL。

飽和吸附量的測定
    稱取1. 000 g 濕樹脂于錐形瓶中, 加入50 mL 0. 8mg/m L 的羅漢果皂甙水提取物, 封口, 于室溫下震蕩吸附24 h。分別于吸附前后測定溶液中羅漢果皂甙的濃度, 按下式計(jì)算飽和吸附量:
Q 0 = (C0 - C1) ×V/W
    式中　Q 0—— 飽和吸附量,mg/g; C0—— 吸附前濃度,mgömL ; C1—— 吸附后濃度,mg/mL ; V —— 溶液體積,mL ; W —— 大孔樹脂濕重, g。

羅漢果皂甙靜態(tài)吸附試驗(yàn)
    稱取1. 000 g 濕大孔樹脂置于錐形瓶中, 加入50mL 0. 8 m gömL 的羅漢果皂甙水提取物, 封口, 每隔20m in 從上清液中取樣0. 5 mL , 測定其吸光度, 然后按下式計(jì)算吸附量:
    Q = (C0 - C1) ×V/W
    以吸附量為縱坐標(biāo), 作用時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制靜態(tài)吸附曲線。

羅漢果皂甙靜態(tài)解吸試驗(yàn)
    稱取0. 500 g 濕大孔樹脂3 份, 各加入15 mL 0. 8m gömL 的羅漢果皂甙提取物水溶液, 于室溫下吸附24h 后, 將充分吸附了羅漢果皂甙水溶液的樹脂進(jìn)行過濾, 去除水液, 再將其置于錐形瓶中, 各加入15mL 95%乙醇溶液, 封口, 分別于20℃, 40℃, 60℃下進(jìn)行解吸, 每隔3 m in 測定解吸液中羅漢果皂甙的濃度, 并繪制解吸曲線, 同時(shí)根據(jù)吸附量計(jì)算解吸率。

羅漢果皂甙的動態(tài)吸附試驗(yàn)
    準(zhǔn)確吸取20 mL (約17. 93 g)D101 大孔樹脂裝柱,以濃度為4 m göm L 的羅漢果皂甙水提取物溶液上柱,流速2 mL /m in, 分部收集流出液, 定時(shí)測定流出液中的羅漢果皂甙濃度, 然后以洗脫液體積為橫坐標(biāo), 流出液中羅漢果皂甙含量為縱坐標(biāo)繪制動態(tài)吸附曲線。吸附達(dá)到飽和后, 計(jì)算飽和動態(tài)吸附量。

洗脫劑及其濃度的選擇
    取一定量的羅漢果皂甙提取物水溶液, 上柱, 先用蒸餾水洗脫至無色后, 依次用50mL 10%～ 80% 濃度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫, 收集不同濃度的乙醇洗脫液并定容至50 mL , 取其中3 mL 洗脫液稀釋至10 mL 后測定其羅漢果皂甙的濃度, 以確定最佳的洗脫劑濃度。

上樣液最適pH 值的選擇
    將羅漢果皂甙水提物溶液(pH 值6. 0) 用氫氧化鈉溶液調(diào)至不同的pH 值, 上柱, 依次用50 mL 同樣pH 值的水溶液, 蒸餾水及60% 的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫, 收集60% 的乙醇洗脫液(pH 值6.0) , 定容至50mL , 取3mL洗脫液稀釋至10 mL , 測定羅漢果皂甙的濃度, 確定其最佳pH 值。

羅漢果皂甙V , 11-O -羅漢果皂甙V 及羅漢果皂甙IV 的高效液相分析
    對照品溶液的配制: 準(zhǔn)確稱取羅漢果皂甙V , 11-O-羅漢果皂甙V 及羅漢果皂甙IV 對照品0. 005 g, 用23%乙腈水溶液溶解并定容至10 mL , 配制成混合對照品溶液。
    樣品溶液的配制: 準(zhǔn)確稱取各樣品0. 010 g, 用23%乙腈溶解并定容至10mL , 配制成1. 0m göm L 的樣品溶液。
    色譜條件: Hypersil ODS C18 柱(250 mm ×4. 6mm , 5μm, 大連伊利特科學(xué)儀器公司) ; 流動相: 乙腈:水= 23∶77 (v/v) ; 流速: 0. 5 mL /m in; 柱溫: 30℃; 檢測波長: 210 nm; 進(jìn)樣量: 10. 0μL。以保留時(shí)間定性, 根據(jù)峰面積計(jì)算樣品的含量。

結(jié)果與分析
    樹脂的吸附特性
    通過對大孔樹脂D 101,D 3520,D 2400,N K-9 的初步篩選發(fā)現(xiàn), 大孔樹脂D 101對羅漢果皂甙的吸附、解吸效果較好, 因此本實(shí)驗(yàn)以大孔樹脂D 101為柱材料, 研究其對羅漢果皂甙的分離純化效果。結(jié)果表明, 大孔樹脂D 101的堆積密度為0. 8965 g/m L。對羅漢果皂甙的飽和吸附量為25. 45m g/g , 飽和吸附率為82. 23% , 40℃時(shí)的平衡解吸率為87. 73%。

羅漢果皂甙的靜態(tài)吸附曲線
    由圖1 可知, 隨著時(shí)間的遞增, 大孔樹脂D 101對羅漢果皂甙的吸附量也相應(yīng)提高。且在120m in 內(nèi)吸附基本達(dá)到飽和, 說明大孔樹脂D 101可對羅漢果皂甙進(jìn)行富集與純化。

羅漢果皂甙的靜態(tài)解吸曲線
    大孔樹脂D 101對羅漢果皂甙的靜態(tài)解吸作用見圖2。結(jié)果表明, 溫度影響羅漢果皂甙的解吸平衡, 溫度越高, 解吸平衡所需時(shí)間越短, 解吸越快。但當(dāng)溫度較高時(shí), 不易進(jìn)行工藝操作, 綜合有關(guān)因素, 選用40℃時(shí)進(jìn)行洗脫, 利于工業(yè)化大規(guī)模制備。

羅漢果皂甙的動態(tài)吸附曲線
    由圖3 可知,D 101大孔樹脂對羅漢果皂甙有良好的動態(tài)吸附性能, 在較長時(shí)間內(nèi)保持低濃度泄漏。直到洗脫液到30 mL 時(shí), 流出液中羅漢果皂甙的濃度才達(dá)0. 036 m g/m L 左右。但是, 此時(shí)泄漏速度開始快速增加, 當(dāng)洗脫液體積到達(dá)105 mL 時(shí), 已達(dá)到吸附平衡, 此時(shí)大孔樹脂的飽和動態(tài)吸附量為21 m göm L。

洗脫劑濃度的選擇
    樹脂吸附羅漢果皂甙后, 可選用對羅漢果皂甙溶解度較高的溶劑如甲醇、乙醇作洗脫劑。考慮到工業(yè)生產(chǎn)時(shí), 甲醇的毒性較大, 因此選用乙醇作為解吸劑。圖4 即為依次采用不同濃度乙醇溶液對羅漢果皂甙的洗脫效果圖。結(jié)果表明, 10%～ 30% 的乙醇水溶液對羅漢果皂甙的洗脫能力較差, 洗脫液中皂甙的含量很少; 當(dāng)乙醇濃度增至為40% 時(shí), 隨乙醇濃度的升高, 洗脫液中皂甙的含量逐漸增大, 以60% 乙醇洗脫液中皂甙的含量最高。隨后, 再用70% 及80% 的乙醇溶液進(jìn)行洗脫, 洗脫液中皂甙含量較少, 表明采用60% 的乙醇洗脫液便可將大部分的羅漢果皂甙解吸。因此, 優(yōu)選的洗脫條件為: 在洗脫過程中, 先用蒸餾水及30% 乙醇水溶液進(jìn)行洗脫以去除雜質(zhì), 再用對羅漢果皂甙洗脫能力最佳的60% 乙醇水溶液進(jìn)行洗脫, 收集60% 乙醇洗脫液。

上樣液pH 值對柱分離效果的影響
    在羅漢果皂甙的分離純化中, 最難去除的是色素類雜質(zhì)。圖5 表明, pH 值呈堿性時(shí), 大孔樹脂對羅漢果皂甙的分離純化效果較好, 且色素吸附少, 有明顯的脫色效果, 其中以pH 值9. 0 時(shí)的分離效果最佳。這是由于在一定堿性條件下, 羅漢果皂甙比較穩(wěn)定, 以分子形式存在, 而色素類等雜質(zhì)以離子形式存在, 同時(shí)由于大孔吸附樹脂只對分子態(tài)物質(zhì)有吸附, 對離子態(tài)的物質(zhì)無吸附, 從而使羅漢果皂甙得以富集、純化。

高含量羅漢果皂甙提取物的制備及分析
    綜上所述, 羅漢果皂甙分離的最佳條件為: 上樣液的pH 值為9. 0, 依次用pH 值9. 0 的氫氧化鈉水溶液、蒸餾水、30% 的乙醇溶液及60% 的乙醇溶液進(jìn)行洗脫, 收集60% 乙醇洗脫液, 濃縮并冷凍干燥, 可得高含量羅漢果皂甙提取物(M G I)。其主要成分的分析結(jié)果見表1。羅漢果皂甙V , 11-O-羅漢果皂甙V 及羅漢果皂甙IV 為羅漢果中主要的皂甙成分, HPLC 的分析結(jié)果表明, 經(jīng)柱層析分離制備的羅漢果皂甙提取物(M G I)中這三種皂甙成分的含量均高于分離前的羅漢果皂甙水提物(M GC) , 三種皂甙成分的總含量達(dá)85. 70% , 尤其是羅漢果皂甙V 的含量達(dá)到69. 24% , 比分離前羅漢果皂甙V 的含量提高了41. 12% , 表明此方法可有效的分離純化羅漢果皂甙, 顯著提高提取物中羅漢果皂甙的含量。

結(jié)　論
    本研究表明, 大孔樹脂D101 對羅漢果皂甙具有吸附快、解吸率高及洗脫率高等特點(diǎn), 且再生簡便, 可較好的分離、純化羅漢果中的羅漢果皂甙。最佳分離條件為:上樣液pH 值9. 0, 在40℃條件下依次采用pH 值9. 0 的氫氧化鈉水溶液、蒸餾水、30% 乙醇及60% 乙醇進(jìn)行洗脫, 收集60% 乙醇洗脫液, 濃縮并冷凍干燥。與目前常用的樹脂分離方法相比, 本文建立的工藝通過改變上樣液的pH 值及乙醇的洗脫濃度和條件, 便可顯著提高提取物中羅漢果皂甙V 等主要皂甙成分的含量。同時(shí), 為工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種簡單、快速的分離純化方法。