[器材和試劑]
● MicroAmp反應(yīng)管 （Perkin Elmer）
● 洗脫緩沖液（20mmol/L Tris—Cl pH8．5， 2mmol/LEDTA，1％Triton X—100）
● Gene Amp9600 PCR儀（Perkin Elmer）
● 正向引物： 5’—AGAGATTACGCCAAGCC—3’（7．5pmol）
● 反向引物： 5’—TCCCAGTCACGACGT—3’（7．5pmol）
● dNTP
● NP—40 （Nonidet P—40）
● Tag緩沖液（50mmol/LKCl，10mmol/L Tris—Cl pH 8．3， 1．5mmoI/L MgCl2， 0，01％明膠）
● Ampi-Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer）
● LB—瓊脂培養(yǎng)基+Amp板[LB—瓊脂培養(yǎng)基，50ug/ml Amp）
● Sephacril S—300（Amersham Biosciences）
● Silent MonitorM膜底微孔板（Model SMl20LP， 1．2um Loprodyne； Pall Bio Support）
● 真空過濾器（mod．EVENT 4160，Ep— pendorf）
[方法]
1．用無菌塑料吸嘴挑取一個AmpR噬菌粒菌落（直徑大約lmm）并將其轉(zhuǎn)入到0．2ml MicroAmp反應(yīng)管中， 內(nèi)含20u1洗脫緩沖液。在GeneAmp9600 PCR儀中，95℃加熱樣本10分鐘（避免用離心澄清，因?yàn)榧訜峥墒辜?xì)胞碎片黏附在管底）。
2．將菌落提取物作為該克隆的主拷貝保存。另外，這些菌落也可以直接轉(zhuǎn)移到PCR反應(yīng)體系中，并在PCR程序中插入加熱步驟。此時，可將克隆主拷貝穿刺接種到在用UV滅菌并鋪有LB—瓊脂培養(yǎng)基+Amp的微板孔中。
3．配置PCR反應(yīng)體系：將3ul菌落提取物加入到一個0．2ml MicroAmpTM反應(yīng)管中；反應(yīng)管包含150nmol/L正鏈引物和反鏈引物、50mmol/L dNTP、0．5％NP-40、Taq緩沖液和1ul AmpllTag DNA聚合酶，終體積為50ul。按以下程序運(yùn)行PCR反應(yīng)：94℃10秒、60℃10秒、72℃10秒，共循環(huán)30次。
4．在SilentMonitor膜底微板的各孔中，裝入Sephacril“S-300的水性懸液，使每孔中含有400ul穩(wěn)定床體積介質(zhì)。用真空過濾器在板底形成真空狀態(tài)，
5．吸取各個克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并加入到含有已抽干的Sephacril孔中。真空抽吸收集96孔板中的濾液（PCR擴(kuò)增模板的大小決定了采用何種凝膠過濾介質(zhì)：我們發(fā)現(xiàn)，Sephacril S-300對分離我們的300bpPCR擴(kuò)增片段效果最佳。按照上述流程，無論樣本的處理或收集均比使用商業(yè)供應(yīng)的裝入微量離心管的旋轉(zhuǎn)柱更加容易和快速，還節(jié)省材料成本）。
6．用已純化的PCR產(chǎn)物，按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行測序。
