張新榮

清華大學(xué)分析中心

一、砷元素的形態(tài)及其特性

砷是一種廣泛分布于自然界的元素�？死�克值為5×10－4,宇宙豐度為4.0。除發(fā)現(xiàn)少量的天然砷外，已知有150多種含砷礦物。最普通的礦物是：砷化物礦，硫化物礦，氧化物礦，砷酸鹽礦。此外，海水中平均含有1.1mgL－1的砷，在礦泉水、土壤和人體中都有微量的砷。

近年來(lái)，由于采煤及其它工業(yè)污染,使地下水中砷的濃度不斷增加，砷污染已經(jīng)成為一個(gè)潛在的公共衛(wèi)生問(wèn)題，亞洲地區(qū)特別是孟加拉國(guó)地下水的砷污染問(wèn)題已經(jīng)受到國(guó)際社會(huì)特別的關(guān)注。據(jù)的統(tǒng)計(jì)，我國(guó)目前有11個(gè)省的部分地區(qū)受到地下水中砷的污染，比較嚴(yán)重的山西、內(nèi)蒙、貴州等地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重的地方性砷中毒。

由于飲用水中含有的砷超過(guò)一定限量會(huì)引起慢性中毒，因此世界衛(wèi)生組織規(guī)定生活飲用水安全標(biāo)準(zhǔn)為每升含砷不超過(guò)0.05毫克。2001年1月，EPA提出一個(gè)新的標(biāo)準(zhǔn)，即生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)每升含砷不超過(guò)0.01毫克，并決定從2006年起實(shí)施，歐盟也計(jì)劃實(shí)行這一標(biāo)準(zhǔn)。但是，對(duì)發(fā)展中國(guó)家來(lái)說(shuō)，要按照這一新標(biāo)準(zhǔn)控制飲用水中的砷含量尚有一定困難，2004年由世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國(guó)兒童基金會(huì)和世界銀行聯(lián)合在我國(guó)太原召開的有關(guān)減輕砷中毒為主題的大會(huì)上，亞洲各國(guó)仍建議延緩啟動(dòng)新標(biāo)準(zhǔn)。

除飲用水外，在所有的生物中都可以檢出低含量的砷，海洋動(dòng)物中存在的高含量砷是人們特別關(guān)注的問(wèn)題。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY5073)規(guī)定魚中無(wú)機(jī)砷含量不得超過(guò)0.5毫克/公斤，其它水產(chǎn)品中含量不得超過(guò)1.0毫克/公斤。這一規(guī)定實(shí)際存在一定的執(zhí)行難度，因?yàn)閲?guó)標(biāo)目前推薦的方法只能測(cè)定總量，不能區(qū)分砷的形態(tài)，而由于魚和其它海產(chǎn)品中大部分砷是無(wú)毒的有機(jī)砷化合物，可達(dá)幾十個(gè)毫克/公斤，因此，測(cè)量結(jié)果偏高的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。例如2004年在香港媒體上報(bào)道多次的魚罐頭事件，就是因?yàn)闄z出了其中高含量的砷，引起規(guī)模超過(guò)5億元的內(nèi)地魚罐頭產(chǎn)業(yè)近來(lái)一直不景氣。實(shí)際上，國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)產(chǎn)品并未超標(biāo)，只是檢測(cè)方法存在問(wèn)題罷了。由此可見(jiàn)，區(qū)分砷元素不同形態(tài)的檢測(cè)方法的研究是十分重要的。

在自然界，砷元素可以以許多不同形態(tài)的化合物存在，在空氣、土壤、沉積物和水中發(fā)現(xiàn)的主要砷化物有As2O3或亞砷酸鹽(As Ⅲ)、砷酸鹽(As Ⅴ)、一甲基砷酸(MMA)和二甲基砷酸(DMA)，在海產(chǎn)品中則主要以砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)形式存在。另外，還有其他更復(fù)雜的砷化合物，例如砷糖(Arsenosugars)、砷脂類化合物等。

主要砷化物對(duì)大鼠的半致死量LD50(mg kg)分別為:As2O3 34.5,亞砷酸鹽(As III)14，砷酸鹽(As V)20，MMA 700-1800，DMA 700-2600，AsC 6500，AsB>10000。這些數(shù)據(jù)表明,無(wú)機(jī)砷的毒性最大,甲基化砷的毒性較小,而AsB、AsC和砷糖常被認(rèn)為是無(wú)毒的。正是由于各種不同形態(tài)的砷具有不同的物理及化學(xué)性質(zhì)，例如各種不同形態(tài)的砷具有不同的毒性，因此砷的形態(tài)分析才越來(lái)越為人們所重視。

由于不同形態(tài)砷化物的毒性不同,其在人體內(nèi)的遷移、轉(zhuǎn)化和代謝規(guī)律就與其致毒和去毒的機(jī)理有關(guān)。砷在體內(nèi)的代謝過(guò)程一般為:As（III）→As（V）→MMA→DMA→尿排出,而AsB在體內(nèi)不經(jīng)任何轉(zhuǎn)變即排出。這說(shuō)明As（III）→DMA是主要的去毒過(guò)程。在致毒方面,亞砷酸鹽通過(guò)阻止含鄰位巰基的酶在活性中心作用而表現(xiàn)其急性毒性，而砷酸鹽由于其結(jié)構(gòu)與磷酸鹽類似，在ATP形成過(guò)程中可取代磷酸鹽而破壞磷�；�作用。另外,不同形態(tài)的砷化物對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)及產(chǎn)量都有明顯的影響。因此無(wú)論對(duì)環(huán)境樣品、食品，還是對(duì)從事與砷有關(guān)的工作人員或砷中毒患者的體液進(jìn)行砷的形態(tài)分析都是有必要的。

傳統(tǒng)方法中，只測(cè)定樣品中的總砷量，不能給出有關(guān)毒性的確切信息。因此，從正確估計(jì)砷對(duì)環(huán)境及人類的危害角度出發(fā)，需要建立一種地分離、測(cè)試各種形態(tài)砷化合物的手段。另外對(duì)于砷在環(huán)境中的循環(huán)、轉(zhuǎn)化機(jī)理的研究也要求對(duì)其進(jìn)行形態(tài)分析。

二、分離方法

在砷形態(tài)分析的初期，一些傳統(tǒng)的方法被用于分離或測(cè)定各種砷的形態(tài)，如蒸餾分離法，共沉淀分離法，單質(zhì)砷沉淀法，萃取分離法和選擇性還原法等。自從70年末以來(lái)，有很多新方法用于此目的。常用的是氣相色譜，液相色譜和毛細(xì)管電泳的方法。

• 氣相色譜

要使不同形態(tài)的砷化物適用于氣相色譜分離，首先要將它們轉(zhuǎn)化為氣態(tài)或可揮發(fā)的液態(tài)衍生物。這些衍生物要具備良好的揮發(fā)性，良好的化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，而且衍生反應(yīng)能適用于多種砷形態(tài)。常用于砷形態(tài)分析的衍生方法有：氫化物法，二硫代氨基甲酸衍生法，三甲基硅烷衍生法，DMA的碘代二甲基砷氫化物法以及巰基乙酸甲酯（TGM）衍生法等。

在氣相色譜中衍生物一般被溶于某一溶劑，然后在液態(tài)下進(jìn)樣于色譜柱中。但是對(duì)砷的分離而言，因?yàn)闅浠�物的揮發(fā)性太大，不易被萃入溶劑，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)都是將氫化物發(fā)生器與氣相色譜系統(tǒng)直接相連，發(fā)生的氫化物通過(guò)載氣被直接帶入色譜柱。二甲基砷化氫可以被萃入甲苯后進(jìn)入色譜柱，但這種方法對(duì)其他砷的氫化物就不合適，如甲基砷化氫揮發(fā)性較前者大，用甲苯萃取損失很大，而在低溫下（-5℃）二甲基砷化氫，一甲基砷化氫均可被萃入甲苯中。氣相色譜分離后砷的氫化物可直接進(jìn)入發(fā)射光譜，質(zhì)譜，及原子吸收光譜等測(cè)定。氫化物發(fā)生－氣相色譜方法的缺點(diǎn)是只能局限于形成氫化物的那些砷的形態(tài)分析。

氣相色譜分離不同形態(tài)砷化物的一些典型的例子包括：（1）Fukui等人[4]利用2，3－二巰基丙醇（BAL）與無(wú)機(jī)砷和MMA形成絡(luò)合物，然后在涂有20％SE－30Chromosorb AWA DMCS的氣相色譜柱上加以分離，并用火焰光度計(jì)檢測(cè)。（2）Beckmann[5]利用MMA、DMA與巰基乙酸甲酯形成絡(luò)合物并在涂有2.5%XE－60 Chromosorb G AW－DMCS柱上將它們分離，用火焰離子化檢測(cè)器測(cè)定，檢測(cè)限達(dá)到10ng/ml。此方法應(yīng)用于尿和血樣的分析。（3）Dix等人[6]利用TGM為衍生劑，分離了無(wú)機(jī)砷、MMA和DMA，并用于尿、血及生物器官提出液的分析，采用火焰離子化檢測(cè)，檢測(cè)限為100ng/ml。（4）Henry等人[7]將As（Ⅲ），As（V）和DMA轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的三甲基硅烷衍生物，并在涂有5％OV－225的Gas－Chrom Q 色譜柱上分離，質(zhì)譜儀檢測(cè)。As（V）和DMA的檢測(cè)限為0.1ng，As（Ⅲ）的檢測(cè)限為1ng。（5）Daughbrey等人[8]以二乙基二硫代氨基甲酸酯為衍生劑，使之與無(wú)機(jī)砷，MMA絡(luò)合生成的低沸點(diǎn)化合物，然后在涂有5％OV－17Anakrom AS 柱上得到分離，熱導(dǎo)及火焰電離技術(shù)檢測(cè)，可用于尿樣的分析。

氣相色譜用于砷的形態(tài)分析的關(guān)鍵是需要選擇一個(gè)好的衍生方法，能夠同時(shí)使幾種重要的砷化物被衍生成低沸點(diǎn)衍生物。但上述幾種衍生方法只對(duì)部分砷化物適用，使得該方法在砷形態(tài)分析上局限很大。同時(shí)由于氣相色譜所必需的衍生反應(yīng)，操作復(fù)雜且易造成玷污，因此近幾年逐漸被液相色譜分離的手段所取代。但是盡管氣相色譜具有這些不利因素，由于它本身固有的分離效率高，容易與檢測(cè)器如原子吸收、原子發(fā)射及質(zhì)譜相聯(lián)機(jī)的優(yōu)點(diǎn)，氣相色譜在形態(tài)分析中仍然占有一席之地。

• 液相色譜

液相色譜用于砷的形態(tài)分析有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，在液相色譜中分析物不必衍生而能直接在室溫下分離。一般樣品都以液相存在，如分析水樣，尿樣，生物器官和組織提取液中的砷形態(tài)等，可以經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的前處理后直接進(jìn)樣于色譜柱加以分析，這樣不僅節(jié)約了分析時(shí)間，而且能夠減少在衍生過(guò)程中帶來(lái)的玷污及各種形態(tài)的重排反應(yīng)和它們之間的相互轉(zhuǎn)化，使得分析數(shù)據(jù)更加。其次，液相色譜可以選擇眾多的流動(dòng)相作為分離介質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)所要分析的形態(tài)的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)纳�譜體系，這使得液相色譜在分離方面具有多樣性。目前在砷的形態(tài)分析中一般采用兩種分離機(jī)理：離子交換機(jī)理和反相離子對(duì)色譜機(jī)理。

（1）離子交換色譜

不同形態(tài)的砷化物能夠被離子交換色譜分離的主要原因是因?yàn)檫@些砷化物在分離條件下大多數(shù)是以離子型化合物存在的。表1列出幾種重要砷化物的pKa值。

表1幾種重要的砷形態(tài)的pKa值

從表1可見(jiàn)，As（Ⅲ），As（V），DMA，MMA和AsB是弱酸或中強(qiáng)酸。而且pKa值相差也比較大，在適宜的pH條件下均能以陰離子的形式存在。此外，已經(jīng)知道AsC只能以陽(yáng)離子形式存在，DMA和AsB則在一定PH值下可同時(shí)以陽(yáng)離子及陰離子形式存在。因此可以用離子交換機(jī)理來(lái)進(jìn)行分離。

采用離子交換分離時(shí)，流動(dòng)相的優(yōu)化可依據(jù)砷元素在不同pH下的形態(tài)分布圖為指導(dǎo)。從圖1可以看出，當(dāng)采用陰離子色譜柱時(shí)，pH6是一個(gè)理想的條件，在這一pH之下，AsIII主要以不帶電荷的亞砷酸（H3A）形式存在，在陰離子色譜柱上無(wú)保留；二甲基砷以HA和A-各占一半的形式存在，因此在陰離子色譜柱上有一定保留；一甲基砷以HA-的形式存在，因此在陰離子色譜柱上保留強(qiáng)于二甲基砷；而AsV部分已經(jīng)以HA2-的形式存在，是這幾種離子中保留最強(qiáng)的，因此流出，從而使這幾種砷的形態(tài)被相互分離。由此可見(jiàn)，pH6是采用陰離子色譜柱分離時(shí)的流動(dòng)相條件。

圖1砷元素在不同pH下的形態(tài)分布圖

圖2a,b是本書作者等采用兩種離子交換柱分離不同形態(tài)有機(jī)砷化合物的色譜圖。從圖2a可以看出，當(dāng)在pH為6.0的條件下，四種以陰離子形態(tài)存在的砷化合物As（III），As（V），MMA和DMA獲得了很好的分離[9]。從圖2b可以看出，在較強(qiáng)的酸度下，除MMA以外，5種有機(jī)砷的化合物都能夠質(zhì)子化形成陽(yáng)離子化合物，因此可用陽(yáng)離子交換柱分離。MMA不保留，因此在死時(shí)間流出[10]。

圖2a陰離子交換柱分離砷化合物1-As（III），2-DMA,3- MMA和4-As（V）

圖2b陽(yáng)離子交換柱分離1-MMA，2-DMA，3-AsB，4-AsC，5-TMAO，6-TMAs+

一般文獻(xiàn)報(bào)道用陰離子交換機(jī)理來(lái)分離陰離子型的砷形態(tài)，用陽(yáng)離子交換機(jī)理分離陽(yáng)離子型的砷形態(tài)，但將陰陽(yáng)離子型砷形態(tài)同時(shí)分離有一定困難。本書作者等曾采用陰離子交換柱嘗試分離As（Ⅲ），As（V），DMA，MMA，AsB和AsC等6個(gè)形態(tài)的砷化物[11]，由于AsC不能以陰離子形態(tài)存在，因此在死時(shí)間流出，其它5種離子的流出順序見(jiàn)圖3。但是，這一分離方法存在的主要問(wèn)題是與色譜柱使用壽命有關(guān)，新柱子的分離效果并不好，用一段時(shí)間后分離效率提高，但是再用一段時(shí)間，分離效果又變差了。因此我們并不推薦采用這一分離方式。也有人甚至利用一根離子交換柱分離8種或更多的砷化物，但是實(shí)際存在同樣的問(wèn)題。

圖3用陰離子交換柱Supelcosil LC SAX分離六種圖4反相離子對(duì)色譜分離人血清中的四種砷化物

砷化物（流動(dòng)相：20 mmol l-1 NH4H2PO4, pH 3.9）；1－As（Ⅲ），2－DMA，3－MMA； 4－As（V）

1, AsC; 2, AsIII; 3, DMA; 4, AsB; 5, AsV; and 6, MMA.

（2）反相離子對(duì)色譜

反相色譜的固定相通常是非極性的，要適于反相色譜分離，分析物應(yīng)該是疏水性物質(zhì)。若要使離子型物質(zhì)能夠在反相柱上分離，則需要將它轉(zhuǎn)化為疏水性物質(zhì)。反相離子對(duì)色譜是用含一個(gè)長(zhǎng)鏈有機(jī)基團(tuán)的離子與和它帶相反電荷的所要分離的化合物形成疏水性的離子對(duì)化合物，然后在非極性的反相柱上分離。

如表4.2所見(jiàn)，As（Ⅲ），As（V），DMA，MMA均可以陰離子形式存在，它們?cè)谑杷�性的反相色譜柱上不被保留，也就不能被分離。但是用一長(zhǎng)鏈烷基（>4）的季銨鹽可與上述陰離子砷化物形成離子對(duì)化合物，這種化合物表現(xiàn)出疏水性而能被反相柱保留并分離。對(duì)于陽(yáng)離子型的砷形態(tài)，則采用陰離子型的對(duì)離子，如烷基磺酸鹽類，這里烷基碳鏈一般為七碳以上，以形成的離子對(duì)化合物的疏水性。本書作者曾采用反相離子對(duì)色譜分離過(guò)人血清中的As（Ⅲ），As（V），DMA，MMA等四種不同形態(tài)的砷化物，色譜見(jiàn)圖4[12]。其它關(guān)于離子對(duì)反相色譜應(yīng)用于砷的形態(tài)分析的實(shí)例列于表2中。從表中可見(jiàn)，由于幾種重要的砷化物有的是陰離子型，有的是陽(yáng)離子型，有的則以兩性存在，用一種對(duì)離子試劑同時(shí)分離表1所列的幾種形態(tài)的砷化物尚有一定困難。