本CCK-8細胞活力檢測試劑盒含有WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽),在電子載體存在的情況下WST-8被細胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成水溶性的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中,生成的甲臜量與活細胞數(shù)量成正比。CCK-8法是用于測定細胞增殖或毒性實驗中活細胞數(shù)目的一種高靈敏度,無放射性的比色檢測法,可替代傳統(tǒng)的MTT法。

試劑盒以外自備儀器和試劑
低速離心機、酶標(biāo)儀(450nm波長)、平板搖床、微量移液器、96孔培養(yǎng)板、CO2培養(yǎng)箱

操作步驟
1. 通常細胞增殖實驗每孔加入100ul (2000個細胞),細胞毒性實驗每孔加入100ul(10000個細胞) (具體每孔所用的細胞的數(shù)目,需根據(jù)細胞的大小、細胞增殖速度的快慢等因素決定)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時 (在37℃,5% CO2的條件下)。

2. 按照實驗需要,進行培養(yǎng)并給予0-10ul特定的藥物刺激。

3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)一段適當(dāng)?shù)臅r間 (例如: 24小時或48小時)。

4. 每孔加入10ul  CCK-8溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為200ul,則需加入20ul CCK-8溶液,其它情況以此類推。可以用加了相應(yīng)量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。如果擔(dān)心所使用的藥物會干擾檢測,需設(shè)置加了相應(yīng)量細胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。 (盡量不要在孔中生成氣泡)

5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

6. 用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

7. 如果暫時不測定OD值,打算以后測定的話,可以向每孔中加入10 μl 0.1 M HCl溶液或者1%(W/V)SDS溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

結(jié)果判斷

(1) 細胞的存活率:將各測試孔的OD值減去本底OD值(完全培養(yǎng)基加CCK-8,無細胞),各重復(fù)孔的OD值取均數(shù)±SD細胞的存活率以T/C%表示,T為加藥細胞的OD值,C為對照細胞的OD值。                細胞存活率% =(加藥細胞OD/對照細胞OD)×100

(2) 求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)或T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)。
保存條件
4℃避光,一年有效

注意事項
1. 接種時注意細胞懸液一定要混勻,以避免細胞沉淀下來,導(dǎo)致每孔中的細胞數(shù)量不等,可以每接種數(shù)孔即混勻一下。培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)基容易揮發(fā),為了減少誤差,建議培養(yǎng)板的四邊每孔只加培養(yǎng)基或無菌PBS,而不作為指標(biāo)檢測孔。

2. CCK- 8的 反應(yīng)時間以具體顯色的 時間為準(zhǔn)。 次做實驗時,建議先做數(shù)孔摸索接種細胞的 數(shù)量和加入CCK-8試劑后的 孵育時間。一般情況下,白細胞較難顯色,因此需要較長的CCK- 8反應(yīng)時間或增加細胞數(shù)量 (~105個細胞/孔)。懸浮細胞與貼壁細胞相比較難顯色。對于懸浮細胞,在加入CCK- 8孵育1- 4小時后,可先從培養(yǎng)箱中取出,目測染色程度或用酶標(biāo)儀測定決定CCK- 8 孵育時間。若顯色困難,可將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱,繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時后再測定。對于貼壁細胞,CCK- 8的孵育時間一般為1- 4小時,多數(shù)細胞在培養(yǎng)30分鐘左右即可肉眼觀察到明顯的顯色反應(yīng),培養(yǎng)2-4小時左右檢測效果 。

3. 本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng),如果待檢測體系中存在較多的還原劑,例如一些抗氧化劑會干擾檢測,需設(shè)法去除。含有酚紅的培養(yǎng)基不影響本試劑盒做的測定。

4. 如何判定待測溶液是否有還原性?不含細胞的待測溶液孔中加入CCK-8溶液10μl,孵育1-4小時,測定在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小,說明待檢測體系中存在較少的還原劑,正式檢測時即可直接加入CCK-8 ;如果該吸光度相對較大,說明待檢測體系中存在較多的還原劑,正式檢測時則需要除去培養(yǎng)基,并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次,然后加入新的培養(yǎng)基和10 μl CCK-8進行檢測。

5. 如果樣品為高渾濁度的細胞懸液,建議設(shè)定600 nm (或600 nm以上) 作為參比波長,扣除參比波長的O.D值即可。

6. 請穿實驗服并戴一次性手套操作。