無縫克隆又叫同源重組，它可以將單個(gè)至多個(gè)片段同時(shí)插入到一個(gè)載體中，而不需要進(jìn)行多次的酶切和純化。通常情況下，無縫克隆可以在 5-15 min內(nèi)完成多個(gè)片段的連接，其克隆陽性率高達(dá) 98% 以上。但需要注意的是，我們?cè)跓o縫克隆前進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增的時(shí)候，載體與片段之間、片段與片段之間需有 15-20 堿基的一段同源序列，這是為什么呢？因?yàn)槲覀儫o縫克隆的試劑盒里面存在三種酶，分別是 T5 核酸外切酶、DNA 聚合酶、DNA 連接酶。其中 T5 核酸外切酶具有 5’-3’核酸外切酶的活性，能夠?qū)⑿蛄袕?5’-3’開始降解，此時(shí)暴露出載體以及片段的3’同源序列，經(jīng)過堿基互補(bǔ)配對(duì)，DNA 聚合酶添加缺失堿基后由 DNA 連接酶將片段與載體進(jìn)行連接，從而達(dá)到載體重組的功能。因此，如果不添加同源序列，載體與片段、片段與片段之間將無法進(jìn)行連接。 
無縫克隆引物設(shè)計(jì)

大家現(xiàn)在對(duì)無縫克隆已經(jīng)有一個(gè)深入的了解了，那么我們來看看，在做無縫克隆之前，跑 PCR 的時(shí)候引物設(shè)計(jì)有哪些要求呢？

引物添加的順序 5’-3’：
同源序列+特異性引物（克隆后無需進(jìn)行酶切，適用于表達(dá)載體）
同源序列+保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+特異性引物（克隆后還需要進(jìn)行酶切或者亞克隆）

這里需要提醒大家注意一下，由于無縫克隆的引物在普通 PCR 的引物基礎(chǔ)上添加了額外的附加堿基（同源序列、保護(hù)堿基、酶切位點(diǎn)），Tm 值可能會(huì)較常規(guī)引物的高。但我們?cè)谧?PCR 的時(shí)候，第一、二次循環(huán)，幾乎只有特異性引物的序列與模板結(jié)合，此時(shí)應(yīng)該只計(jì)算特異性引物的 Tm 值，否則會(huì)出現(xiàn)退火溫度過高，PCR 擴(kuò)增不出條帶。但后面的循環(huán)，特異性引物和附加堿基均能夠和第一、二次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行結(jié)合擴(kuò)增，并占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。此時(shí)引物 Tm 值應(yīng)該按照整條引物的 Tm 值計(jì)算。因此，在做無縫克隆前的 PCR 擴(kuò)增時(shí)，建議大家在第二個(gè)循環(huán)后提高退火溫度進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，更有利于產(chǎn)物的形成。

無縫克隆的連接時(shí)間的選擇

雖然說，無縫克隆帶給我們很多的便利，但小編需要告訴大家需要注意一點(diǎn)兒的是，無縫克隆連接的片段數(shù)量有限，一次連接超過 6 個(gè)或者載體+片段超過 13 Kb 后，其連接時(shí)間會(huì)增加且陽性率會(huì)降低，甚至出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)失敗的情況。因此，在做無縫克隆實(shí)驗(yàn)的時(shí)候需要多多計(jì)算一下。